簡明微生物工程 1-1前言

微生物工程授課教師：孫玉unyuying125@163.com

緒論一、微生物工程的概念

微生物工程（Microbialengineering）是利用微生物的特定性狀和功能，通過現(xiàn)代化工程技術(shù)生產(chǎn)有用物質(zhì)或直接應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)的技術(shù)體系；是將傳統(tǒng)發(fā)酵與現(xiàn)代DNA重組、細胞融合、分子修飾和改造等新技術(shù)結(jié)合并發(fā)展起來的現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)。微生物工程是滲透有工程學的微生物學，是發(fā)酵技術(shù)工程化的發(fā)展。生物工程(bioengineering)二、微生物工程的地位與作用生物技術(shù)(biotechnology)生物技術(shù)是21世紀高新技術(shù)革命的核心內(nèi)容，生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)將是21世紀的支柱產(chǎn)業(yè)生物技術(shù)在迎接人口、資源、能源、食物環(huán)境等五大危機的挑戰(zhàn)中將大顯身手。許多國家都將生物技術(shù)確定為增強國力和經(jīng)濟發(fā)展的關(guān)鍵技術(shù)之一。生物工程微生物工程基因工程細胞工程酶工程基因工程基因工程（geneengineering），又稱為重組DNA技術(shù)，是按著人們的科研或生產(chǎn)需要，在分子水平上，用人工方法提取或合成不同生物的遺傳物質(zhì)（DNA片段），在體外切割，拼接形成重組DNA,然后將重組DNA與載體的遺傳物質(zhì)重新組合，再將其引入到?jīng)]有該DNA的受體細胞中，進行復(fù)制和表達，生產(chǎn)出符合人類需要的產(chǎn)品或創(chuàng)造出生物的新性狀，并使之穩(wěn)定地遺傳給下一代。酶工程酶的大批量生產(chǎn)以及利用酶的催化作用,借助工程技術(shù)手段進行物質(zhì)轉(zhuǎn)化,生產(chǎn)人們所需要產(chǎn)品的技術(shù).細胞工程是指應(yīng)用現(xiàn)代細胞生物學、發(fā)育生物學、遺傳學和分子生物學的理論與方法，按照人們的需要和設(shè)計，在細胞水平上的遺傳操作，重組細胞的結(jié)構(gòu)和內(nèi)含物，以改變生物的結(jié)構(gòu)和功能，即通過細胞融合、核質(zhì)移植、染色體或基因移植以及組織和細胞培養(yǎng)等方法，快速繁殖和培養(yǎng)出人們所需要的新物種的生物工程技術(shù)。微生物工程

是生物技術(shù)的重要組成和基礎(chǔ)，是生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化的重要環(huán)節(jié)。它將微生物學、生物化學和化學工程的基本原理有機結(jié)合起來，廣泛而深入地揭示了發(fā)酵過程的本質(zhì)。完整的微生物工程應(yīng)該包括從投入原料到最終產(chǎn)品獲得的整個過程。微生物工程學就是要研究和解決在這整個過程中的工藝和設(shè)備問題，將實驗室和中型試驗所取得的成果迅速擴大到工業(yè)化生產(chǎn)中去。三、微生物反應(yīng)過程的特點一）優(yōu)點：

（與化學工程相比）1、生產(chǎn)過程通常在常溫常壓下進行，操作條件溫和，不需考慮防爆問題，一種設(shè)備具有多種用途。2、原料以碳水化合物為主，不含有毒物質(zhì)。3、生產(chǎn)過程是以生命體的自動調(diào)節(jié)方式進行的，因此多個反應(yīng)就象一個反應(yīng)一樣，可在單一設(shè)備（發(fā)酵罐）中進行。4、能容易地生產(chǎn)復(fù)雜的高分子化合物，如酶、光學活性體等。5、能高度選擇性地進行復(fù)雜化合物在特定部位反應(yīng)，如氧化、還原、官能團導(dǎo)入等。6、生產(chǎn)產(chǎn)品的生物體本身也是發(fā)酵產(chǎn)物，富含維生素、蛋白質(zhì)、酶等有用物質(zhì)；除特殊情況外，培養(yǎng)液一般不會對人和動物造成危害。8、通過微生物菌種改良，能夠利用原有設(shè)備使生產(chǎn)水平飛躍上升。發(fā)酵過程的這些特性決定了微生物工程的種種優(yōu)點，使得微生物工程成為生物技術(shù)的核心之一而受到廣泛重視。7、發(fā)酵生產(chǎn)在操作上最需要注意的是防止雜菌污染。進行設(shè)備的沖洗、滅菌、空氣過濾等，使全過程在無菌狀態(tài)下運轉(zhuǎn)，是非常重要的。一旦失敗，就要遭受重大損失。特別是噬菌體對發(fā)酵的危害更大。二）發(fā)酵過程中尚存在的問題：1、底物不能完全轉(zhuǎn)化成目的產(chǎn)物，副產(chǎn)物的產(chǎn)生不可避免，因而造成提取和精制困難，這是目前發(fā)酵行業(yè)下游操作落后的原因之一。2、微生物反應(yīng)是活細胞的反應(yīng)，產(chǎn)物的獲得除受環(huán)境因素影響外，也受細胞內(nèi)因素的影響，且菌體易發(fā)生變異。3、原料是農(nóng)副產(chǎn)品，雖然價廉，但質(zhì)量波動較大。4、生產(chǎn)前準備工作量大，花費高，相對化學反應(yīng)而言，反應(yīng)器效率低。5、通常底物濃度不能過高，且要在無雜菌污染情況下進行。6、發(fā)酵廢水常具有較高的BOD和COD，需處理后排放。四、微生物工程發(fā)展簡史1、傳統(tǒng)的微生物發(fā)酵技術(shù)——天然發(fā)酵幾千年酒（古埃及公元前4000–3000年；追溯到4000年前的龍山文化時期）啤酒、黃酒、醬油、泡菜等2、第一代微生物發(fā)酵技術(shù)——純培養(yǎng)技術(shù)

LouisPasteur微生物引起發(fā)酵；酒精發(fā)酵由酵母引起

EduardBuchner酒化酶(zymase)

RobertKoch發(fā)明了固體培養(yǎng)基；建立了純培養(yǎng)技術(shù)

人為控制發(fā)酵過程

酒精、丙酮、丁醇、有機酸等

（主厭氧發(fā)酵；初級代謝產(chǎn)物）3、第二代（近代）微生物發(fā)酵技術(shù)——深層培養(yǎng)技術(shù)

出現(xiàn)于20世紀40年代，以抗生素的生產(chǎn)為標志

青霉素的發(fā)現(xiàn)與大量需求

表面培養(yǎng)法(扁瓶，濕麩皮)，效價40U/mL，純度20%，收率30%深層培養(yǎng)技術(shù)

——機械攪拌通氣發(fā)酵

鏈霉素、氯霉素、金霉素、土霉素、四環(huán)素等

抗生素工業(yè)的發(fā)展促進了其他發(fā)酵產(chǎn)品的出現(xiàn)，如氨基酸發(fā)酵工業(yè)

好氧發(fā)酵，初級、次級代謝產(chǎn)物青霉素產(chǎn)量改變發(fā)展史二十世紀四十年代初，第二次世界大戰(zhàn)爆發(fā)，青霉素的發(fā)現(xiàn)，迅速形成工業(yè)大規(guī)摸生產(chǎn)。1928年由Fleming發(fā)現(xiàn)青霉素1941年美國和英國合作對青霉素進行生產(chǎn)研究表面培養(yǎng)：1升扁瓶或錐形瓶，內(nèi)裝200mL麥麩培養(yǎng)基───40u/ml1943年沉浸培養(yǎng)：5m3───200u/ml當今：100m3─200m3───5-7萬u/ml鏈霉素、金霉素、新霉素、紅霉素4、第三代發(fā)酵技術(shù)——微生物工程

（1972）DNA重組技術(shù)、原生質(zhì)體融合技術(shù)等應(yīng)用

1982，第一個基因工程產(chǎn)品——利用工程菌生產(chǎn)的人胰島素問世

現(xiàn)有許多種類的產(chǎn)品紅細胞生成素(治療貧血)

生長激素(促進生長)胰島素(治療糖尿病)

干擾素(抗病毒、抗腫瘤)

五、微生物工程的應(yīng)用食品加工：單細胞蛋白（酵母、真菌等）含醇飲料：葡萄酒、黃酒、白酒、啤酒、白蘭地、威士忌發(fā)酵乳制品：奶酪、酸奶調(diào)味品：味精、肌苷酸、醬油、醋等微生物技術(shù)最早開發(fā)應(yīng)用的領(lǐng)域，至今產(chǎn)量和產(chǎn)值仍占微生物工程的首位1、在食品工業(yè)的應(yīng)用（一）微生物工程應(yīng)用領(lǐng)域2、在醫(yī)藥衛(wèi)生中的應(yīng)用

抗生素：12000余種青霉素、金霉素、四環(huán)素、鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、新霉素、螺旋霉素、頭孢霉素等

氨基酸：可發(fā)酵生產(chǎn)的有谷、賴、丙、組、異亮、亮、苯丙、脯、蘇、色、酪、纈、瓜、鳥氨酸（國內(nèi)40億元，占發(fā)酵業(yè)產(chǎn)值12%）

維生素：VB2、VB12、Vc、VA、VD等

生物制品：亞單位疫苗、重組疫苗、DNA疫苗等

酶抑制劑：

棒酸（可抑制-內(nèi)酰胺酶對青霉素的破壞）-淀粉酶的抑制劑可治療糖尿病膽固醇抑制劑可治療高血壓高血脂3、在輕工業(yè)中的應(yīng)用糖酶：-淀粉酶、-淀粉酶、異淀粉酶、木聚糖酶、葡萄糖異構(gòu)酶、半乳糖酶、纖維素酶等蛋白酶：堿性蛋白酶（洗滌劑、皮革鞣化、啤酒去濁）酸性蛋白酶（飲料、制蛋白水解物）中性蛋白酶（皮革脫毛、蠶絲脫膠、蛋白胨制備）果膠酶：果汁果酒澄清、苧[zhù]

麻脫膠脂肪酶：分解脂肪為脂肪酸和甘油凝乳酶：制干酪氨基?；浮⒏事毒厶敲傅?、在化工能源中的應(yīng)用醇及溶劑：乙醇、甘油、異丙醇、丙酮、丁醇、丁二醇等有機酸：醋酸、丙酸、乳酸、琥珀酸、蘋果酸、衣康酸、水楊酸等多糖：黃原膠、海藻糖等清潔能源：微生物燃料電池（可以生產(chǎn)氫氣）等5、在農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用生物農(nóng)藥：

殺蟲劑（Bt、白僵菌、病毒、微孢子蟲）

防治植物病害（假單孢菌、木霉、弱病毒、慶豐霉素）生物除草劑：利用雜草的病原微生物生物增產(chǎn)劑：根瘤菌、藍細菌、鉀細菌、磷細菌等生物殺蟲劑的種類及應(yīng)用

微生物殺蟲劑種類很多，已發(fā)現(xiàn)的有2000多種，按照微生物的分類可分為細菌、真菌、病毒、原生動物和線蟲等。目前，國內(nèi)研究開發(fā)應(yīng)用并形成商品化產(chǎn)品的主要有細菌類殺蟲劑、真菌類殺蟲劑、病毒類殺蟲劑和抗生素類殺蟲劑。1細菌殺蟲劑細菌類殺蟲劑是國內(nèi)研究開發(fā)較早的生產(chǎn)量最大、應(yīng)用最廣的微生物殺蟲劑。目前，研究應(yīng)用的品種有蘇云金桿菌、青蟲菌、日本金龜子芽孢桿菌和球形芽孢桿菌，其中蘇云金桿菌是最具有代表性的品種。蘇云金桿菌(Bt)是一種能產(chǎn)生伴孢晶體毒素，昆蟲寄主譜較廣的重要昆蟲病原菌，是一種胃毒性殺蟲劑。大量的試驗和實際應(yīng)用表明，蘇云金桿菌對多種農(nóng)業(yè)害蟲有不同程度的毒殺作用，這些害蟲包括棉鈴蟲、煙青蟲、銀紋夜蛾、斜紋夜蛾、甜菜夜蛾、小地老虎、稻縱卷葉螟、玉米螟、小菜蛾和茶毛蟲等，對森林害蟲松毛蟲有較好效果。另外，還可用于防治蚊類幼蟲和儲糧蛾類害蟲。真菌殺蟲劑

真菌殺蟲劑是一類寄生譜較廣的昆蟲病原真菌，是一種觸殺性微生物殺蟲劑。目前，研究利用的主要種類有：白僵菌、綠僵菌、擬青霉、座殼孢菌和輪枝菌。白僵菌

白僵菌是我國研究時間最長和應(yīng)用面積最大的真菌殺蟲劑。白僵菌的寄主很多，可防治對象有玉米螟、松毛蟲、多種金龜子、水稻葉蟬、飛虱、桑天牛、茶小葉蟬、茶毛蟲、大豆食心蟲和蚜蟲等，特別是對玉米螟和松毛蟲，已作為常規(guī)手段連年使用。3

病毒殺蟲劑

病毒殺蟲劑是一類以昆蟲為寄主的病毒類群，雖研究開發(fā)比細菌殺蟲劑晚，但近年來發(fā)展迅速。應(yīng)用比較普遍的有核型多角體病毒(NPV)、顆粒體病毒(GV)和基因工程棒狀病毒。我國科技人員經(jīng)過多年的努力，已開發(fā)出多種野生型昆蟲病毒復(fù)合殺蟲劑產(chǎn)品，并實現(xiàn)商品化。利用基因工程技術(shù)開發(fā)的重組病毒殺蟲劑也已進入田間釋放階段。從1993年國內(nèi)第1個昆蟲病毒殺蟲劑——棉鈴蟲核型多角體病毒完成產(chǎn)品注冊登記至今，已有10幾家產(chǎn)品獲得登記，包括：棉鈴蟲、斜紋夜蛾、菜青蟲、黃地老虎和茶尺蠖等，年產(chǎn)量約2000t。4

農(nóng)用抗生素

農(nóng)用抗生素是我國較早研究開發(fā)的微生物農(nóng)藥，但在殺蟲抗生素上的研究開發(fā)近十幾年來才取得了重大突破。阿維菌素是目前已知的最具代表性的抗生素類殺蟲劑，以其作為主要成分的復(fù)配制劑目前已有80多個品種，該產(chǎn)品殺蟲譜廣，不易產(chǎn)生抗性，對多種害蟲和害螨都具有良好的防效，該產(chǎn)品已成功地實現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化。國內(nèi)完成進入產(chǎn)業(yè)化開發(fā)的其他品種還有瀏陽霉素、殺蚜素、華光霉素、南昌霉素、韶關(guān)霉素和梅嶺霉素等。目前，我國已登記產(chǎn)品62個，生產(chǎn)企業(yè)100多家。5

昆蟲病原線蟲、微孢子蟲

這兩種殺蟲劑研究起步較晚，產(chǎn)品也初步達到實用化程度，但由于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)方法存在一些問題，沒有形成規(guī)?；a(chǎn)。產(chǎn)品有小卷蛾線蟲，用于防治小菜蛾，蝗蟲微孢子蟲防治牧草的蛀蟲。

6、在環(huán)境保護中的作用污水處理（厭氣法、好氣法）7、在高技術(shù)領(lǐng)域中的應(yīng)用基因工程的各種工具酶等二）微生物工程產(chǎn)品類型1、微生物菌體的發(fā)酵SCP、藥用真菌（冬蟲夏草【麥角科，蟲草屬真菌】、茯苓（為多孔菌科寄生植物茯苓的干燥菌核）等）。生物防治制劑（如蘇云金桿菌）活性乳制劑細胞的生長與產(chǎn)物的積累成平行關(guān)系，生長速率最大的時期也是產(chǎn)物合成最高階段2、微生物酶發(fā)酵各種酶制劑糖化酶、氨基?；福―L氨基酸光學拆分）、蛋白酶、脂肪酶等3、微生物代謝產(chǎn)物發(fā)酵初級代謝產(chǎn)物：

與菌體生長相伴隨的產(chǎn)物，

氨基酸、核苷酸、維生素、有機酸、溶劑

菌體對其合成反饋控制嚴密，一般不過量積累次級代謝產(chǎn)物：

與菌體生長不相伴隨，以初級代謝產(chǎn)物為原料而合成

抗生素、生物堿、毒素、胞外多糖等

結(jié)構(gòu)常較復(fù)雜對環(huán)境條件敏感4、微生物的生物轉(zhuǎn)化

利用微生物細胞的一種或幾種酶，對外源化合物的特定部位進行加工，如加入羥基、還原雙鍵、脫氧或切斷支鏈等。

轉(zhuǎn)化的最終產(chǎn)物并不是微生物細胞利用營養(yǎng)物質(zhì)經(jīng)細胞代謝產(chǎn)生，而是微生物細胞的酶或酶系作用于底物的某一部位，進行特定部位的化學反應(yīng)而形成。

反應(yīng)最顯著的特點是特異性強，包括反應(yīng)特異性、結(jié)構(gòu)位置特異性、立體特異性

含環(huán)戊烷多氫菲核的化合物；

甾族激素：分腎上腺皮質(zhì)激素