6種藥物對人細胞色素p4503a4及其4個突變等位基因重組酶的體外抑制

6種藥物對人細胞色素p4503a4及其4個突變等位基因重組酶的體外抑制

細胞色素p450（cyp450）是含有糊精素的酶蛋白，也被稱為混合功能氧化酶或單加氧酶。這是肝臟中最重要的藥物代謝i相酶。cyp4503a4（cyp3a4）是一個重要的藥物代謝酶。肝臟中的含量約為cyp450總量的30%，但臨床上約50%的藥物是由它代謝的。CYP3A4基因具有多態(tài)性且其多態(tài)性存在種族差異,CYP3A4(WT)是CYP3A4亞家族最主要的基因型;CYP3A4*3(M445T)、CYP3A4*4(I118V)、CYP3A4*17(F189S)和CYP3A4*18(L293P)是WT的基因非同義突變所得。通過體外研究基因突變導致酶氨基酸改變,從而引起酶學性質(zhì)的變化,為臨床個體化用藥指導和預測有關的藥物相互作用等奠定基礎。1材料和方法1.1合成產(chǎn)物的純化WT、M445T、I118V、F189S和L293P重組酶由陜西北美基因股份有限公司饋贈[整合有P450氧化還原酶基因的釀酒酵母(Saccharomycescerevisia)系統(tǒng)表達所得],二甲基熒光素(DBF)和標準品熒光素購自美國BD公司,硝苯地平、標準品氧化硝苯地平、6-磷酸葡萄糖脫氫酶、NADP+、葡萄糖-6-磷酸、尼群地平、酮康唑、地爾硫卓、維拉帕米購自美國Sigma-Aldrich公司,大扶康、萬絡和西樂葆為本實驗室人員經(jīng)HPLC純化所得,其他試劑均為國產(chǎn)分析純;GeminiXPS/EM型連續(xù)熒光檢測儀為美國MolecularDevices公司產(chǎn)品,Aglient2100型高效液相色譜儀為美國安捷倫公司產(chǎn)品。1.2方法采用熒光高通量法和HPLC法分別測定各重組酶動力學參數(shù)和各種藥物對各重組酶的抑制程度。1.2.1高光刻法1.2.1.連續(xù)熒光檢測反應在96孔板中進行,每一樣品12孔,每孔總體積100μl。先將各重組酶和底物(DBF)各10μl加入到96孔板中,置于連續(xù)熒光檢測儀中37℃孵育10min,再加入NADPH再生系統(tǒng)80μl(其中各物質(zhì)終濃度分別為:3.3mmol/L葡萄糖-6-磷酸、0.4U/ml6-磷酸葡萄糖脫氫酶、3.3μmol/LNADP+、0.41mmol/LMgCl2)起始反應,檢測用激發(fā)光波長為485nm,發(fā)射光波長為538nm,實時檢測熒光值。1.2.1.kentorth模式下的酶動物熒光值檢測酶活性檢測:DBF終濃度為0.25μmol/L,WT、M445T、I118V、F189S、L293P終濃度分別為:0.0125、0.025、0.05、0.1、0.2和0.4mg/ml,37℃“KINETICS”模式下每2min讀數(shù)1次,共30次。根據(jù)產(chǎn)物(熒光素)的標準曲線,將檢測的相對熒光值的單位轉(zhuǎn)換為摩爾濃度;以酶溶液的濃度為橫坐標,產(chǎn)物(熒光素)的摩爾濃度值為縱坐標進行線性回歸,求出酶催化反應的酶濃度線性范圍,在線性范圍內(nèi)任取一點作為進行酶動力學檢測實驗的最佳酶濃度。酶動力學檢測:各重組酶濃度為確定的最佳酶濃度,底物DBF濃度為:0、0.125、0.5、1、2和4μmol/L,其他物質(zhì)的濃度和具體操作方法與1.2.1.1同,利用GraphPadPrism軟件計算Km、最大酶促反應速度(Vmax)值,并根據(jù)公式(內(nèi)在清除率=Vmax/Km)計算內(nèi)在清除率的值。1.2.1.其他5種藥物酶的降解DBF終濃度分別選擇酶Km值附近,酮康唑濃度梯度為:0.004、0.008、0.016、0.03、0.06、0.12、0.25、0.5、1、2和4μmol/L,其他5種藥物濃度梯度均為:0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64和128μmol/L,各重組酶終濃度均為0.1mg/ml,將酶、底物、藥物都加入96孔板后,于37℃反應20min,同時設陽性對照(不含藥物)和陰性對照(不含藥物和酶),加入50μl的1mol/L的NaOH終止反應,并于陰性對照中加入10μl酶,連續(xù)熒光檢測儀“ENDPOINT”模式下讀數(shù)1次,記錄熒光值,參考文獻方法計算IC50。1.2.2hplc法1.2.2.乙腈終止液終止反應c的檢測操作與1.2.1.1同,除底物外,各物質(zhì)終濃度不變,總體積400μl。NADPH再生系統(tǒng)與硝苯地平置于1.5ml離心管中,37℃水浴孵育5min,各重組酶起始反應,15min后加入含120μl4μmol/L的尼群地平的乙腈終止液終止反應(尼群地平作為反應內(nèi)標);冰浴10min,加入640μl萃取劑二氯甲烷和2mol/LNaCl80μl,劇烈震蕩10s,冰浴10min,4℃,13000×g離心10min,吸取下層有機相600μl至新的1.5ml離心管中,真空干燥后用50μl64%的甲醇水溶液溶解樣品。色譜條件:C18高碳反向柱(4.6mm×150mm,5μm),流動相:A(水):B(甲醇)=36:64,流速:0.8ml/min,進樣體積25μl,檢測波長254nm,柱溫30℃。產(chǎn)物、底物和內(nèi)標保留時間分別為:4.2、5.8和10.9min。1.2.2.基本反應條件標準品氧化硝苯地平從8μmol/L2倍稀釋至0.0625μmol/L,基本反應條件和操作步驟同1.2.2.1。以標準品氧化硝苯地平的濃度為橫坐標,標準品與內(nèi)標的峰面積之比(A標準品/A內(nèi)標)為縱坐標建立標準曲線。1.3突變等位基因與野生型重組酶的內(nèi)在清除率的計算利用GraphPadPrism軟件行統(tǒng)計學分析,數(shù)據(jù)用表示,比較各突變等位基因與野生型重組酶的內(nèi)在清除率,采用不配對的t檢驗,n≥3,P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。2結果2.1催化底物硝苯地平的活性除F189S外,各酶均能催化DBF脫烷基化生成產(chǎn)物熒光素,硝苯地平氧化反應生成產(chǎn)物氧化硝苯地平。設定WT的催化活性為100%,其他各突變等位基因酶的催化活性分別與其相比得出:催化底物DBF脫烷基化反應,I118V和F189S與WT的活性相比,分別減少15%和88%,M445T與WT相當,而L293P卻提高約40%;催化底物硝苯地平的反應,M445T、I118V和F189S與WT的活性相比,分別減少41%、31%和99%,L293P卻提高約59%(圖1)。由于F189S催化DBF反應的活性只有WT的12%,活性喪失明顯,因此無法進行酶動力學檢測實驗。催化底物DBF反應時,WT、M445T、I118V和L293P的Km值均較接近,而各重組酶Vmax與內(nèi)在清除率差異較大(圖2),M445T和L293P的內(nèi)在清除率與WT相比,P<0.05,具有統(tǒng)計學意義;但I118V與WT間差異無統(tǒng)計學意義(表1)。催化底物硝苯地平反應時,M445T、I118V和L293P與WT相比,Km分別是WT的1.6、2.0和1.3倍。Vmax分別是WT的1.6、1.4和2.8倍(圖3)。WT、M445T、I118V和L293P對硝苯地平的內(nèi)在清除率分別為:0.17、0.17、0.12和0.45μl/(min·pmolP450),后3者M445T、I118V和L293P的內(nèi)在清除率分別是WT的1.0倍(P=0.7676)、0.7倍(P=0.0121)和2.6倍(P=0.02)(表2)。3討論3.1cyp3a4蛋白表達酶動力學結果表明,酶催化2種底物(DBF和硝苯地平)的反應間無相關性。同一等位基因重組酶催化底物DBF或硝苯地平時,盡管各動力學參數(shù)間存在底物依賴性,但各重組酶與WT相比時卻存在相同的趨勢。以F189S和L293P為例,前者對2種底物均無催化活性,而后者與WT的催化活性相比均有較強增長。晶體結構顯示CYP3A4識別并結合底物的結構域較其他亞家族CYP蛋白大,且活性中心亞鐵血紅素基團上存在苯丙氨酸簇(Phe-108,Phe-213,Phe-215,Phe-241,Phe-304),有助于底物與活性中心的識別。苯丙氨酸簇上方存在1個由螺旋F、G和螺旋F′、G′共同形成的平面,該平面與底物的識別有關,并且存在非正規(guī)的二級結構。F189S的189位的苯丙氨酸位于苯丙氨酸富含區(qū),該區(qū)域與底物的識別作用有關,當苯丙氨酸突變成絲氨酸以后,親水性的羥基替代了疏水性的苯環(huán),可能阻礙苯丙氨酸簇的正確形成,同時阻礙疏水性底物與亞鐵血紅素的結合,故其催化活性明顯降低,催化DBF和硝苯地平反應的活性的改變也恰恰證明了這種結構的變化。M445T和L293P分別在CYP3A4晶體結構的L和I螺旋起始端,I118V位于B′螺旋中間,這些位點既沒有占據(jù)蛋白酶的活性中心,也沒有明顯影響酶和底物的結合,它們的不同可能是因為氨基酸的改變致使蛋白酶結構發(fā)生微小變化,從而引起CYP450酶和細胞色素b5或者和NADPH-P450還原酶相互作用時的不同,這就解釋了為什么催化不同底物時,各等位基因重組酶同樣存在代謝差異的原因?？傊?這些突變位點雖然沒有直接占據(jù)蛋白酶的活性部位,但這些氨基酸的改變可能會影響到蛋白酶構象、底物進入的通路或酶的催化活性,從而酶動力學性質(zhì)表現(xiàn)出與WT存在差異。3.2藥物不良反應同種藥物在催化不同的底物反應時,CYP3A4的IC50值會相差300倍,由于CYP3A4的底物結合域較大,因此不同的底物可能會存在不同的結合位點,因而引起藥物對酶的抑制程度不同。催化底物DBF和硝苯地平反應時,藥物對WT抑制的IC50值與文獻報道范圍相符。已撤出市場的萬絡對WT及各突變等位基因重組酶的催化活性均無明顯的抑制作用,提示該藥可能在體內(nèi)不經(jīng)CYP3A4代謝,Genebank檢索使其得到證實。酮康唑均強烈抑制WT和各突變等位基因重組酶的活性,IC50值為0.01μmol/L左右。酮康唑的雜環(huán)氮原子能與CYP450血紅素中的鐵原子直接結合抑制其催化活性,能使CYP3A4的底物(如特非那定、阿司咪唑、西沙必利)血藥濃度升高,顯著延長Q-T間期,使一些敏感的病人最終發(fā)生尖端扭轉(zhuǎn)型室性心動過速而致死。與酮康唑相比,大扶康對WT和各突變等位基因重組酶的活性抑制程度遠小于酮康唑。因此若使用與酮康唑類似結構的藥物時,應降低該藥物的使用劑量,或選擇大扶康代替酮康唑,以免發(fā)生嚴重的藥物不良反應。另外,降血壓藥地尓硫卓、維拉帕米都對WT和各突變等位基因重組酶的活性呈現(xiàn)中等強度抑制,與已有研究結果一致。它們與CYP3A4代謝的底物同時服用同樣可能存在藥物不良反應。各類藥物對WT和各突變等位基因重組酶活性的抑制趨勢大致相同,但針對某種藥物,CYP3A4依然存在多態(tài)性現(xiàn)象。且對CYP3A4的抑制作用存在明顯的底物依賴現(xiàn)象,即同種抑制劑在不同的催化反應中可能對CYP3A4的抑制程度不同。以西樂葆為例,當?shù)孜餅镈BF時,藥物對WT、I118V和L293P來說屬于中等強度抑制劑,對M445T無抑制;但底物為硝苯地平時,西樂葆對WT弱抑制,而不抑制其他各突變等位基因重組酶的活性,因此若同時服用西樂葆與經(jīng)CYP3A4酶代謝的藥物時,除了參考病人的基因特征以外,還應該了解同時服用的藥物的結構特征,以便選擇合適的藥物劑量,避免發(fā)生的藥物相互作用和不良反應。如果病人基因型為I118V和L293P時,同時服用的藥物結構與DBF的結構類似,則需降低西樂葆使用劑量;若同時服用的藥物結構與硝苯地平類似,即使聯(lián)合用的藥物都采用正常劑量,也不存在產(chǎn)生藥物相互作用的風險。當然,把體外數(shù)據(jù)直接外推至體內(nèi)是不太現(xiàn)實的。已有報道表明,試圖在體內(nèi)和體外數(shù)據(jù)之間建立聯(lián)系十分困難,但這并不能否定體外研究的意義。因CYP3A4的等位基因在人群中的分布頻率較低,臨床研究找出足夠的人群樣本相對困難,且在體內(nèi)CYP3A4常以雜合子形式存在,因此體內(nèi)實驗很難找到合適的研究標本。本實驗的藥物代謝酶表現(xiàn)出了米氏動力學、底物依耐性和對酶的抑制作用的多態(tài)性,也表現(xiàn)出與其他CYP亞型和人的肝臟微粒體的不同之處?？傊?通過研究等位基因突變對酶活性和藥物作用的影響,為實現(xiàn)個體化用藥提供了理論基礎?；谏矸磻尼槍YP450的抑制劑進行的藥物篩選,在新藥研發(fā)過程中能使研究人員確定繼續(xù)研究可避免此類傾向的化合物,從而降低代價較高的失敗的可能性。1.2.2.重組酶的檢測操作方法同1.2.1.2。底物硝苯地平設不同的濃度:2.5、5、10、20、40、80μmol/L,各重組酶濃度均為0.2mg/ml,反應結束后在色譜圖上讀出產(chǎn)物的峰面積值,求出產(chǎn)物與內(nèi)標的峰面積比值(A產(chǎn)物/A內(nèi)標)后,值帶入1.2.2.2建立的標準曲線,根據(jù)標準曲線求出反應生成的產(chǎn)物濃度,再除以反應的時間,計算出反應速率。1.2.2.酮康唑溶液標準操作方法與1.2.2.1同。底物硝苯地平濃度的選擇與熒光高通量法同,酶濃度均為0.2mg/ml,酮康唑濃度分別為0.0164、0.49、0.15、0.44、1.33、4μmol/L,其他5種