補(bǔ)腎中藥對(duì)地塞米松灌胃大鼠下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸功能受抑的實(shí)驗(yàn)研究

補(bǔ)腎中藥對(duì)地塞米松灌胃大鼠下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸功能受抑的實(shí)驗(yàn)研究

本實(shí)驗(yàn)采用外源性糖皮質(zhì)激素地塞米松灌胃，建立了植物腦出血-體育皮質(zhì)（hpa）軸功能受抑制模型。采用電子顯微鏡、光學(xué)顯微鏡和血漿皮質(zhì)酮放射免疫成像等技術(shù)手段。從形式和功能兩個(gè)方面，它將重點(diǎn)從腎上腺束狀帶細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化出發(fā)，并對(duì)上述動(dòng)物進(jìn)行了研究。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)亦模擬臨床,從激素對(duì)人體影響的不同階段進(jìn)行滋腎陰和溫腎陽(yáng)這兩組藥物作用的觀察,以便為皮質(zhì)激素應(yīng)用過(guò)程中陰陽(yáng)轉(zhuǎn)化物質(zhì)基礎(chǔ)的研究,進(jìn)一步提供實(shí)驗(yàn)性依據(jù)。動(dòng)物的標(biāo)本采集及觀察指標(biāo)實(shí)驗(yàn)分7天實(shí)驗(yàn)及30天實(shí)驗(yàn)。一、7天實(shí)驗(yàn):采用Wistar系成年雄性大鼠48只,平均體重267g(235～297g);隨機(jī)分入4個(gè)實(shí)驗(yàn)組:對(duì)照組(C)、激素組(D)、激素加滋腎陰中藥組(DYi)、激素加溫腎陽(yáng)中藥組(DYa)。藥物制備:地塞米松混懸液:每毫升混懸液含地塞米松15μg。滋腎陰中藥:采用生地、知母、生甘草,用量為3:1:1,加水2500ml,煮沸濃縮過(guò)濾至含生藥1.0g/ml。溫腎陽(yáng)中藥:采用附子、肉桂、肉蓯蓉、補(bǔ)骨脂、仙靈脾,用量為6:3:10:10:10,加水2500ml,煮沸濃縮過(guò)濾至含生藥0.78g/ml。各組動(dòng)物以下列藥物灌胃:C組以生理鹽水(1.5ml/100g體重);D組以地塞米松混懸液(7.5μg/100g體重)和生理鹽水;DYi組以地塞米松混懸液和滋腎陰中藥(1.0ml/100g體重);DYa組以地塞米松混懸液和溫腎陽(yáng)中藥(1.0ml/100g體重)。其中地塞米松劑量相當(dāng)于50kg體重成人劑量的5倍,中藥劑量相當(dāng)于50kg體重成人劑量的10倍。實(shí)驗(yàn)條件:室溫12～20℃,濕度77～93%。灌胃時(shí)間:每日下午5時(shí),共灌胃7次。標(biāo)本采集及觀察指標(biāo)1.血標(biāo)本采集及3H-血漿皮質(zhì)酮測(cè)定:最后一次灌胃后39小時(shí),即第9日晨8時(shí)斷頭處死;動(dòng)物由籠內(nèi)取出至斷頭,間隔不超過(guò)15秒。留取軀體血,用于血漿皮質(zhì)酮測(cè)定(3H-皮質(zhì)酮放射免疫試劑盒由上海市內(nèi)分泌研究所提供)。2.組織標(biāo)本采集:所有動(dòng)物均取雙側(cè)腎上腺。按系統(tǒng)抽樣設(shè)計(jì)方法,確定采取電鏡標(biāo)本或光鏡標(biāo)本的動(dòng)物。(1)電鏡標(biāo)本:動(dòng)物處死后迅速取動(dòng)物左側(cè)腎上腺皮質(zhì)中間部,制作電鏡標(biāo)本,透射電鏡觀察腎上腺皮質(zhì)束狀帶。在此基礎(chǔ)上,對(duì)細(xì)胞內(nèi)線粒體和脂滴作定量分析,取下列觀察指標(biāo):皮質(zhì)束狀帶細(xì)胞每線粒體含嵴數(shù),束狀帶一定面積(204μM2,下同)內(nèi)細(xì)胞出現(xiàn)管狀嵴線粒體數(shù)與線粒體總數(shù)之比,以及一定面積內(nèi)細(xì)胞脂滴數(shù)與線粒體總數(shù)之比。(2)光鏡標(biāo)本:以Carnoy氏液固定,腎上腺切片以組織化學(xué)Feulgen反應(yīng)染色后,1500倍光鏡下測(cè)量各實(shí)驗(yàn)組腎上腺皮質(zhì)束狀帶細(xì)胞胞核面積。二、30天實(shí)驗(yàn):采用Wistar成年雄性大鼠122只,平均體重231g(164～272g)。動(dòng)物隨機(jī)分組、各組處理、藥物制備、實(shí)驗(yàn)條件、標(biāo)本采集及觀察指標(biāo)均與7天實(shí)驗(yàn)相同。實(shí)驗(yàn)時(shí)間為30天,中途休息2天,共灌胃28次,最后一次灌胃后39小時(shí),即第30天晨8時(shí)斷頭處死。結(jié)果一、7小鼠肝腎皮質(zhì)束狀帶細(xì)胞電鏡分析1.腎上腺皮質(zhì)束狀帶細(xì)胞電子顯微鏡觀察:電鏡下對(duì)照組束狀帶細(xì)胞為不規(guī)則多邊形,細(xì)胞核位于細(xì)胞正中。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)均勻地布滿線粒體、光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和適量脂滴;線粒體為規(guī)則的圓或卵圓形,基質(zhì)內(nèi)布滿圓形囊泡狀嵴。光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)為小的囊狀或扁板狀結(jié)構(gòu)。脂滴外緣光滑,直徑大的脂滴外圍被一層短小扁囊狀光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)包圍。(圖1)7天實(shí)驗(yàn)各組束狀帶細(xì)胞主要變化:與其對(duì)照組比較,D組束狀帶細(xì)胞線粒體內(nèi)大量囊泡狀嵴轉(zhuǎn)變?yōu)楣軤钺?脂滴數(shù)增多,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)致密螺旋膜狀體(densewhorledmembranousbody,是細(xì)胞磷脂膜局部退行性變的一種形式)。DYi組束狀帶細(xì)胞線粒體內(nèi)見(jiàn)少量囊泡狀嵴轉(zhuǎn)變?yōu)楣軤钺?脂滴數(shù)減少。DYa組線粒體內(nèi)有中等量囊泡狀嵴轉(zhuǎn)變?yōu)楣軤钺?脂滴數(shù)增多。(圖2～4)2.7天實(shí)驗(yàn)各組電鏡下腎上腺皮質(zhì)束狀帶細(xì)胞線粒體和脂滴定量分析,結(jié)果如表1。從表1可看出,7天實(shí)驗(yàn)各組間束狀帶一定面積內(nèi)細(xì)胞出現(xiàn)管狀嵴之線粒體數(shù),以D組與DYa組為多,C組與DYi組較少。將一定面積內(nèi)細(xì)胞出現(xiàn)管狀嵴之線粒體數(shù)與線粒體總數(shù)之比作比較,C組與D組差別有極顯著意義(P<0.001),DYi組與D組比較,差別有極顯著性(P<0.001),DYa組與D組比較,差別無(wú)顯著意義(P>0.05)。7天實(shí)驗(yàn)各組束狀帶一定面積內(nèi)細(xì)胞脂滴數(shù)與線粒體總數(shù)之比,C組與DYi組較小,D組與DYa組較大;將各組間數(shù)值進(jìn)行比較,C組與D組間,差別有顯著性(P<0.01);DYi組與D組間,差別有極顯著性(P<0.001);而DYa組與D組的差別無(wú)顯著意義(P>0.05)。7天實(shí)驗(yàn)各組間束狀帶細(xì)胞內(nèi)每線粒體含嵴數(shù),差異無(wú)顯著意義(P>0.05)。3.7天實(shí)驗(yàn)各組血漿皮質(zhì)酮水平,列于表2。由表2可見(jiàn),DYi組、DYa組以及C組血漿皮質(zhì)酮水平均高于D組,差別有顯著性(分別為P<0.01,P<0.01和P<0.05)。4.7天實(shí)驗(yàn)各組光鏡下腎上腺皮質(zhì)束狀帶細(xì)胞胞核面積測(cè)量結(jié)果,如表2所示。由表2可看出,7天實(shí)驗(yàn)各組束狀帶細(xì)胞胞核面積以C組及DYi組為大,它們與D組比較,差別分別有顯著性(P<0.05)和非常顯著性(P<0.01)。D組與DYa組細(xì)胞核面積小,兩組間差別無(wú)顯著意義(P>0.05)。二、30束狀帶細(xì)胞胞核面積1.腎上腺皮質(zhì)束狀帶細(xì)胞電子顯微鏡觀察:對(duì)照組所見(jiàn)同7天實(shí)驗(yàn)。其余各組束狀帶細(xì)胞主要變化:與其對(duì)照組比較,D組線粒體嵴數(shù)量減少,多表現(xiàn)為管狀嵴,脂滴多,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)致密螺旋膜狀體。DYi組線粒體含嵴數(shù)量少,多數(shù)為管狀嵴,脂滴多,DYa組線粒體內(nèi)也出現(xiàn)較多管狀嵴,但含嵴數(shù)量尚較多,脂滴較多。(圖5～8)2.30天實(shí)驗(yàn)各組電鏡下腎上腺皮質(zhì)束狀帶細(xì)胞線粒體和脂滴定量分析,結(jié)果如表3。由表3可見(jiàn),30天實(shí)驗(yàn)各組束狀帶細(xì)胞內(nèi)每線粒體含嵴數(shù)以C組為最大,與D組比較,差別有極顯著意義(P<0.001);DYa組線粒體含嵴數(shù)次之,與D組比較,差別有極顯著意義(P<0.001);DYi組與D組最小,兩組間差別無(wú)顯著意義(P>0.05)。30天實(shí)驗(yàn)各組束狀帶一定面積內(nèi)細(xì)胞出現(xiàn)管狀嵴之線粒體數(shù)與線粒體總數(shù)之比,C組及DYa組為小,D組及DYi組為大。各組間進(jìn)行比較,C組及DYa組與D組間差別均有顯著意義(分別為P<0.001及P<0.01):DYi組與D組間差別有顯著意義(P<0.05);而DYi組與DYa組間差別也有顯著性(P<0.05)。30天實(shí)驗(yàn)各組束狀帶一定面積內(nèi)細(xì)胞脂滴數(shù)與線粒體總數(shù)之比,C組與D組比較,差別有極顯著性(P<0.01);DYi組及DYa組分別與D組比較時(shí),差別無(wú)顯著性(P>0.05)。3.30天實(shí)驗(yàn)各組血漿皮質(zhì)酮水平,列于表4,其中C組與DYa組血漿皮質(zhì)酮水平均高于D組,與D組比較,差別均有顯著意義(分別為P<0.05及P<0.01);D組與DYi組比較,差別無(wú)顯著性(P>0.05)。4.30天實(shí)驗(yàn)各組光鏡下腎上腺皮質(zhì)束狀帶細(xì)胞胞核面積測(cè)量結(jié)果,如表4所示。由表4可見(jiàn),各組束狀帶細(xì)胞核面積,以C組及DYa組為大,與D組比較,差別均有非常顯著意義(分別為P<0.001和P<0.01)。DYi組與D組的細(xì)胞核面積小,兩組間差別無(wú)顯著意義(P>0.05)。討論一、功能異常表現(xiàn)為了將與細(xì)胞功能變化相應(yīng)的超微結(jié)構(gòu)變化定量地表示出來(lái),本實(shí)驗(yàn)對(duì)細(xì)胞的線粒體和脂滴作了定量測(cè)定,包括:線粒體含嵴數(shù)、一定面積內(nèi)細(xì)胞含管狀嵴線粒體數(shù)與線粒體總數(shù)之比,以及一定面積內(nèi)細(xì)胞脂滴數(shù)與線粒體數(shù)之比等。Kahri、Fujita、Nussdorfer等的研究指出:線粒體嵴數(shù)目減少,或由囊泡狀轉(zhuǎn)變?yōu)楣軤?必然伴有嵴內(nèi)膜表面積的減少。在細(xì)胞功能亢奮狀態(tài)時(shí),束狀帶細(xì)胞線粒體嵴為圓形囊泡狀;功能低下?tīng)顟B(tài)時(shí),則為管狀。大鼠腎上腺皮質(zhì)類固醇激素合成必需的酶,除部分位于束狀帶細(xì)胞微體碎片(microsomalfraction,來(lái)源于光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng))外,其余部分位于線粒體嵴上。為此,線粒體嵴數(shù)量減少或管狀嵴的出現(xiàn),必伴有相應(yīng)的類固醇生物合成酶的減少。本實(shí)驗(yàn)電鏡資料定量分析中,均以D組的線粒體退行性變化最大。束狀帶細(xì)胞每線粒體含嵴數(shù),30天實(shí)驗(yàn)DYa組接近于C組。一定面積內(nèi)細(xì)胞出現(xiàn)管狀嵴線粒體數(shù),7天實(shí)驗(yàn)DYi組接近于C組:30天實(shí)驗(yàn)DYa組接近于C組。線粒體的這些微細(xì)結(jié)構(gòu)變化表明:各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的不同功能狀態(tài),即7天實(shí)驗(yàn)的DYi組、30天實(shí)驗(yàn)的DYa組束狀帶細(xì)胞功能,未受外源性地塞米松負(fù)反饋抑制的影響。大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為,合成類固醇激素的原料膽固醇,尤其膽固醇酯存在于脂滴內(nèi)。地塞米松使脂滴內(nèi)含物自束狀帶細(xì)胞的釋放延緩或輕度減少,從而使細(xì)胞質(zhì)內(nèi)脂滴數(shù)相對(duì)增加。給動(dòng)物注射ACTH后,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)脂滴數(shù)相對(duì)減少。由此,脂滴數(shù)量的增減也可從一個(gè)側(cè)面反映束狀帶細(xì)胞的功能狀態(tài)。Rhodin指出,束狀帶細(xì)胞質(zhì)內(nèi)線粒體數(shù)和脂滴數(shù)之間有一個(gè)反比關(guān)系,即在脂滴和線粒體總數(shù)不變的條件下,脂滴數(shù)愈多,線粒體數(shù)愈少,表明細(xì)胞功能相對(duì)低下;反之,則表示細(xì)胞功能較為活躍。為此,本實(shí)驗(yàn)選用一定面積內(nèi)脂滴數(shù)與線粒體數(shù)之比這一指標(biāo)。結(jié)果表明,7天實(shí)驗(yàn)的DYi組接近于C組。二、束狀帶細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)檢測(cè)一定量的外源性腎上腺皮質(zhì)類固醇激素使垂體前葉的ACTH釋放迅速受到抑制;后者轉(zhuǎn)而使腎上腺皮質(zhì)類固醇激素的釋放也減少。國(guó)內(nèi)曾有人報(bào)道,外源性腎上腺皮質(zhì)激素造成動(dòng)物腎上腺皮質(zhì)功能的“耗竭”。本實(shí)驗(yàn)采用地塞米松混懸液對(duì)動(dòng)物灌胃,劑量為7.5μg/100g體重。在用藥后7天和30天,D組動(dòng)物的血漿皮質(zhì)酮水平均明顯地低于C組,表明動(dòng)物的HPA軸功能已明顯受抑。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用Feulgen反應(yīng)這一組織化學(xué)專一性的單色染色法,在光鏡下測(cè)量各實(shí)驗(yàn)組束狀帶細(xì)胞核的大小,避免了視野內(nèi)其它有色物體的干擾,結(jié)果以7天實(shí)驗(yàn)DYi組及30天實(shí)驗(yàn)DYa組細(xì)胞核面積接近于C組。進(jìn)一步觀察束狀帶細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)給予地塞米松的D組動(dòng)物束狀帶細(xì)胞線粒體含嵴數(shù)減少,線粒體內(nèi)大量囊泡狀嵴轉(zhuǎn)變?yōu)楣軤钺?脂滴數(shù)增多,細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)致密螺旋膜狀體等等變化。而給予地塞米松同時(shí)還分別給予滋腎陰或溫腎陽(yáng)中藥,可見(jiàn)7天實(shí)驗(yàn)DYi組或30天實(shí)驗(yàn)DYa組的這些由激素引起的“耗竭”性變化要小得多。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,證明這些細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變確實(shí)能反映一定的功能意義。上述電鏡與光鏡的觀察結(jié)果,一方面從形態(tài)學(xué)角度說(shuō)明了D組動(dòng)物腎上腺皮質(zhì)功能處于低下?tīng)顟B(tài),HPA軸受抑動(dòng)物模型成立;另一方面,聯(lián)系各實(shí)驗(yàn)組血漿皮質(zhì)酮水平:7天實(shí)驗(yàn)DYi組及C組均顯著高于D組;30天實(shí)驗(yàn)C組及DYa組均顯著高于DYi組與D組,說(shuō)明了各實(shí)驗(yàn)組不同功能狀態(tài)和形態(tài)結(jié)構(gòu)改變具有一致性。至于7天實(shí)驗(yàn)DYa組血漿皮質(zhì)酮水平高于D組,而束狀帶超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果卻表明此時(shí)DYa組腎上腺皮質(zhì)已處于受抑狀態(tài);對(duì)這一現(xiàn)象的解釋,是否由于:不同的實(shí)驗(yàn)指標(biāo)對(duì)事物變化的敏感程度各異,出現(xiàn)這些變化的時(shí)間亦可前后參差。7天動(dòng)物實(shí)驗(yàn)DYa組血漿皮質(zhì)酮水平這一指標(biāo)尚高于D組時(shí),束狀帶超微結(jié)構(gòu)觀察這一微觀指標(biāo)卻已顯示出受抑的變化,也可能是,在整個(gè)腎上腺皮質(zhì)功能還處于一種代償狀態(tài)時(shí),部分束狀帶細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)已顯示出一定受抑變化;此外,溫補(bǔ)腎陽(yáng)藥是否可能干擾血漿皮質(zhì)酮的測(cè)定,這些都有待于進(jìn)一步研究。三、平臺(tái)3不同階段的特殊藥代動(dòng)力學(xué)上海第一醫(yī)學(xué)院臟象專題組1960年以后的研究表明:腎陽(yáng)虛患者有HPA軸功能低下和紊亂。應(yīng)用溫補(bǔ)腎陽(yáng)藥治療后,則可使大部份患者的功能紊亂從癥狀或臨床檢驗(yàn)上得到改善或糾正。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)還觀察到:長(zhǎng)期大劑量喂飼激素可引起腎上腺皮質(zhì)明顯萎縮,而以滋陰瀉火或溫補(bǔ)腎陽(yáng)中藥與激素同時(shí)喂飼,則可在一定程度上對(duì)抗激素對(duì)腎上腺皮質(zhì)的抑制作用,使皮質(zhì)的萎縮程度明顯減輕。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)除對(duì)照組外,設(shè)D組、DYi組和DYa組,實(shí)驗(yàn)分短期(7天)和長(zhǎng)期(30天)兩大組,以了解補(bǔ)腎中藥配合激素應(yīng)用的不同階段效應(yīng)。綜合7天實(shí)驗(yàn)和30天實(shí)驗(yàn)各組形態(tài)學(xué)和功能定量分析結(jié)果,可以看出,7天實(shí)驗(yàn)的DYi組及C組,其功能明顯優(yōu)于