禽流感疫苗研究進展

禽流感疫苗研究進展摘要對禽流感的防止，必須在采用嚴格的生物安全方法的同時，加強必要的免疫方法。對不同類型禽流感疫苗的研究現(xiàn)狀、優(yōu)越性與局限性進行了綜述。核心詞禽流感；疫苗；研究進展近來，亞洲某些國家不停暴發(fā)的禽流感（Avianinfluenza，AI）事件引發(fā)了人們對全球一系列動物和公眾健康問題的極大關注，近來的聯(lián)合國糧農組織（FAO）羅馬提交會議指出[1]，當面臨AI大流行威脅時，采用大規(guī)模撲殺感染動物的方法會喪失很大一部分食物來源，使地方養(yǎng)禽業(yè)遭受嚴重打擊，顯得不太合理。對禽流感的防止，必須努力集中在采用嚴格的生物安全方法的同時，加強必要的免疫方法。免疫能減輕臨床癥狀，減少死亡率，減少病毒的擴散和提高群體對感染的抵抗力，從而控制禽流感病毒（Avianinfluenzavinus，AIV）的廣泛傳輸[2]。然而，如果疫苗的使用和管理不當，不僅達不到預期的效果，還會污染環(huán)境，威脅公眾健康。因此，研制安全、高效的AIV疫苗是專家們?yōu)橹恍概Φ哪康?。抱負的疫苗應含有高的生物保護容量，同時消除環(huán)境污染和易感動物感染的可能性?？偟膩碚f，對于AIV疫苗的發(fā)展，下列幾個設計思路均已被采用或嘗試。1全病毒滅活疫苗由于AIV基因組的抗原漂移，AIV疫苗僅能提供70%的保護力。針對這種特點，AIV滅活疫苗普通制備成針對幾個不同亞型AIV的多價疫苗，己證明1種滅活疫苗能夠最少涉及4種不同的AIV亞型。同只含單一亞型的疫苗比，多價疫苗并沒有削弱對同一種HA亞型AIV攻擊的有效保護[3]，并且各亞型抗原之間不產生免疫干擾。AIV滅活疫苗能使免疫雞群在感染AIV野毒時有效地減輕損失，并明顯減少可能存在于雞群和環(huán)境中的病毒數(shù)量，縮短其存活時間，是AI防治的主動方法、核心環(huán)節(jié)和最后防線。并且滅活疫苗含有制備工藝簡樸、免疫效果確實、免疫持續(xù)期長等特點，許多國家已將其作為商品化的AIV疫苗應用于家禽中。我國己研制成功不同亞型的AIV疫苗，且證明含有良好的免疫保護作用。但滅活苗本身存在某些缺點[4]，重要是：影響疫情監(jiān)測；存在散播病毒的風險；免疫劑量較大，制備成本高。其最突出的缺點是不能誘導產生有效的粘膜免疫抗體和細胞免疫應答，因而無法有效地克制呼吸道中AIV的復制。近年來，人們試圖從技術上突破此缺點，篩選并運用同亞型弱毒疫苗株替代高致病性毒株制備滅活苗，是滅活苗研制中的努力方向之一。例如用2種不同的病毒同時感染雞胚可造成片段間的重排而有可能產生所盼望的疫苗株，這些疫苗種子株獲得了抗原有關毒株對應的HA和NA基因，和A/PuertoRico/8/34（H1N1）中的6個基因片段[5]。這些PR/8/34的片段賦予病毒弱毒因此能在雞胚中快速生長，適合作為滅活疫苗的生產。2基因工程亞單位疫苗亞單位疫苗是提取AIV含有免疫原性的抗原蛋白，加入佐劑而制成。這種疫苗安全性好，能刺激機體產生足夠的免疫力，只是抗體持續(xù)時間短，且成本高。謝愉快等曾用臺灣AIV分離株（H8N4）的HA和NP制備了復合亞單位疫苗，同時制備了滅活的油佐劑疫苗。當以疫苗誘生的HI抗體作為評價原則時，發(fā)現(xiàn)2種疫苗的差別不明顯，只是在加強免疫后，亞單位疫苗的HI抗體水平的升高比油佐劑疫苗明顯[6]。隨著基因工程技術的不停發(fā)展，將免疫原性基因導入體現(xiàn)載體，經(jīng)誘導可獲得大量體現(xiàn)的免疫原性蛋白，提取所體現(xiàn)的特定多肽，加入佐劑即制成基因工程亞單位疫苗，這樣可大大減少疫苗的成本。Kodihalli等研制了火雞H5N2病毒NP/HA和ISCOM的復合亞單位疫苗，用其免疫火雞，21d可產生較高的抗體滴度，并且T、B淋巴細胞被激活，能夠對同源和異源（H6N1）亞型病毒的攻擊產生保護作用，在攻毒后3d，可去除火雞肺部和泄殖腔的病毒[7]。另外，將AIV的基因插入桿狀病毒體現(xiàn)載體，運用重組病毒在昆蟲細胞中體現(xiàn)的AIV蛋白來制備AIV的亞單位疫苗也已研究成功。Crawford等運用桿狀病毒體現(xiàn)系統(tǒng)生產H5、H7亞型AIV的重組HA佐劑疫苗，免疫3周齡白色Rock雞，用同亞型HPAIV攻擊，成果重組HA佐劑疫苗組全部的雞只均不發(fā)病，而未免疫組雞只全部死亡，且經(jīng)H5亞型病毒的重組亞單位疫苗免疫過的雞攻毒后都不排毒[8]?；蚬こ虂唵挝灰呙绠a生的抗體不針對病毒的內部蛋白，因此不會干擾AIV的血清學調查，并且其不存在毒力返強、散毒和環(huán)境污染的問題，是安全性較好的疫苗。重組桿狀病毒體現(xiàn)的HA亞單位疫苗在禽類體現(xiàn)出良好的免疫原性，免疫后只誘導HA特異性抗體應答，不影響疫情監(jiān)測，顯示出了一定的應用前景。3重組活載體疫苗雞痘病毒作為禽用疫苗病毒載體，含有外源基因容量大、可對體現(xiàn)的外源蛋白進行對的加工修飾、嚴格的宿主特異性和生物安全性等優(yōu)點[9-11]，運用對禽類致病性很弱的痘苗病毒或禽痘病毒作載體，構建含有免疫原性基因的重組病毒，用此重組病毒作疫苗，可在動物體內復制，并不停地體現(xiàn)出免疫原性蛋白，從而誘導禽類產生針對目的病原的免疫保護力。Webster（1995）和Swaynes（1997）先后構建了含A/Ty/Ire/1378/83（H5N8）HA基因的禽痘病毒重組疫苗，用其免疫仔雞，用在墨西哥分離的致死性強毒H5N2攻擊，實驗成果證明該苗可對H5N2提供0%～100%的保護[12]；冀德君、劉紅旗等應用體現(xiàn)H9亞型AIVHA的重組雞痘病毒疫苗及其傳代后第20、30代疫苗免疫5日齡無特定病原（SPF）雞群，攻毒后第5天各免疫組排毒的雞數(shù)與對照組相比明顯減少[13]；程堅等用體現(xiàn)H9亞型AIVHA基因的重組雞痘病毒在7日齡SPF雞及含抗FPV母源抗體的商品雞上進行的免疫效力實驗亦表明，重組雞痘疫苗能明顯克制靜脈攻毒后免疫雞從泄殖腔的排毒，效果與AIV全病毒滅活苗相稱[14]。賈立軍用構建的體現(xiàn)H5N1HA的重組雞痘疫苗免疫SPF雞和無母源抗體的商品雞，免疫雞可抵抗H5N1亞型HPAIV的致死性攻擊，誘導95%～100%的免疫保護[15]。陳平用構建的高效體現(xiàn)H9亞型AIVHA基因的重組雞痘病毒頸部皮下免疫1日齡SPF雞，攻毒后實驗成果表明，rFPV-Ps-HA明顯克制了病毒的排出[16]。以上實驗均表明，攜帶AIVHA基因的重組雞痘疫苗含有良好的效果。同滅活苗相比，攜帶HA基因的重組活載體疫苗不僅可提供相稱的保護效果，并且含有某些獨特的優(yōu)點：安全性高；可通過刺種和皮下注射接種途徑進行免疫，使用方便；免疫應激??；用量少，不需添加佐劑，成本大大減少；并且抗體持續(xù)時間長，效果好，用其免疫家禽，既可刺激宿主產生體液免疫，又能刺激宿主產生細胞免疫[17]?；蛑亟M的雞痘疫苗的最大優(yōu)點是不干擾血清學調查，因此該重組疫苗合用于監(jiān)測野毒感染[4]。4DNA疫苗Ulmer等[18]報道了小鼠肌肉注射含有編碼甲型流感病毒核蛋白（NP）的重組質粒后，不僅產生抗NP的特異性IgG抗體，并且誘導CTL反映，可有效地保護小鼠抗不同亞型分離時間相隔34a的流感病毒的攻擊。Pertmer發(fā)現(xiàn)，流感病毒NP基因的核酸疫苗激活機體的免疫反映不受母源抗體的干擾[19]。同樣，在有母源抗體存在的狀況下，HA和NP基因均能有效激活細胞免疫應答反映。我國研制的H7亞型HA基因DNA疫苗，在極小的使用劑量下即可成功誘導免疫保護反映，并有效阻斷同源MPAIV在機體內的感染和排毒[20]。大量的動物實驗都闡明在適宜的條件下，DNA接種后既能產生細胞免疫又能產生體液免疫[21-24]，于是，DNA疫苗技術應運而生，并逐步顯示出它作為第3代疫苗的優(yōu)越性。與傳統(tǒng)疫苗相比DNA疫苗有許多優(yōu)點：能長時間體現(xiàn)抗原；含有與天然抗原相似的構象和免疫原性，可同時激發(fā)機體產生細胞免疫、體液免疫和粘膜免疫應答，并且不受母源抗體的干擾；構造簡樸，制備方便；穩(wěn)定性好，易于保存和運輸；能夠克服由于免疫系統(tǒng)發(fā)育不完善而造成的免疫力低下的缺點；可用于制備多價疫苗或聯(lián)苗。本文為全文原貌未安裝PDF瀏覽器顧客請先下載安裝原版全文現(xiàn)在，對于DNA疫苗存在著安全方面的考慮：質粒DNA低水平整合到宿主基因組的潛在危險性；DNA疫苗載體攜帶的抗生素基因可能造成的生物學后果；產生針對雙鏈DNA的抗體；引發(fā)免疫耐受。針對上述四種潛在的危害性，美國FDA、WHO及EU都對DNA疫苗的研制制訂了某些指導性規(guī)定，為DNA疫苗的研究、生產及應用指明了方向。由于DNA疫苗代價相對較高，且不適于集約化養(yǎng)殖的群體免疫，因此可考慮改善DNA疫苗生產工藝和優(yōu)化疫苗接種方式來開發(fā)出價格低廉、實用化的DNA疫苗。其中應用減毒胞內菌運輸DNA疫苗的途徑獲得了某些令人振奮的成果。已有了某些比較好的減毒沙門氏菌菌株作為禽類DNA疫苗的運輸載體的研究報道，張小榮等以減毒沙門氏菌運輸H5亞型AIVDNA疫苗的生物學特性研究表明，該疫苗含有良好的安全性和免疫原性，能同時激發(fā)細胞免疫、體液免疫和粘膜免疫應答[25]，這類疫苗仍在探討中，需對這類疫苗進行進一步優(yōu)化，才干最后篩選出真正適合臨床應用的疫苗。5RNA復制子疫苗隨著DNA疫苗的進一步研究，人們緊張DNA會整合到宿主細胞基因組上，造成致癌隱患。另外，DNA通過核膜較為困難，限制了其作用的發(fā)揮，在一定程度上妨礙了DNA疫苗的推廣應用。于是，人們又構想用RNA替代DNA作基因疫苗，近年來開發(fā)的RNA復制子載體應運而生。該RNA復制子能夠不依賴于宿主細胞而自主復制，包含病毒基因組5’和3’末端的順式作用元件、全部非構造蛋白基因編碼區(qū)（涉及復制酶編碼基因），而構造蛋白基因被缺失，由外源基因取代，這種重組病毒粒子能夠很容易地攜帶達3kb的外源RNA，并且感染的細胞譜較廣，涉及非分裂細胞[26]。Vignuzzi等[27]將A型流感病毒A/PR/8/34（ma）株的NP基因插入塞姆利基森林病毒（SFV）載體上構建RNA疫苗，7～8周齡的C57BL/6老鼠肌肉注射10μgSFVRNA，3～4周后再加強1次，共免疫3次。第3次免疫后1～3周，由鼻腔攻入100pfu的A/PR/8/34（ma）病毒。實驗成果不僅有較高的中和抗體出現(xiàn)，并且誘導了有效的CTL反映，實驗小鼠能有效去除肺部的病毒。大量的研究證明DNA/RNA復制子比常規(guī)DNA疫苗的免疫原性好[28]，能夠產生更強的抗體應答和更多的CTL前體，并且使用比常規(guī)DNA疫苗免疫劑量低100倍的復制子疫苗就能夠產生與常規(guī)DNA疫苗相稱的免疫效力?？梢?，RNA復制子載體的特點涉及：復制效率高，用量遠遠低于常規(guī)DNA疫苗；可同時誘導抗體應答和CTL應答；安全性好，RNA復制子在胞漿內復制，避免了核的參加，不存在整合進宿主基因組的可能性；RNA復制子造成轉染細胞的溶解，避免了有自主復制能力的病毒的產生；復制子系統(tǒng)能自主復制，可針對多個病原進行持續(xù)免疫，而不受己有載體病毒抗體的干擾。6冷適應流感弱毒疫苗用野毒株感染雞胚在較低溫度下（25～30℃）培養(yǎng)，持續(xù)傳代后可較快的使病毒的致病力削弱，從而獲得冷適應流感弱毒病毒供體。通過在體現(xiàn)靶HA和NA的野生型病毒和病毒供體如A/AnnArbor/6/60（H2N2）之間的基因重排能夠獲得減毒的冷適應性病毒株，病毒的這些特性與多基因的突變有關。滴鼻免疫減毒的冷適應性的流感活疫苗，能引發(fā)全身和局部粘膜的免疫反映，顯示出保護效力[29]。這些活的減毒病毒顯示出高水平的表型和基因穩(wěn)定性，不會轉變成靠近的有關血清學陰性毒株。已經(jīng)獲得H5N1和H9N2/Ann供體的重組冷適應性病毒。這些病毒不會對哺乳動物和雞致病[30]。即使現(xiàn)在流行的肌注禽流感疫苗能夠有效地誘導有關病毒特異的血清血凝克制IgG抗體，他們卻不能刺激鼻腔產生分泌型IgA抗體[31]。由于分泌型IgA能與異源型的流感毒株交叉反映，活的減毒的禽流感疫苗能夠廣泛地提供針對抗原變異株的交叉保護，一旦新的流感毒株流行時它將非常有用[32，33]。美國對冷適應流感弱毒疫苗的研制己有30數(shù)年的歷史，但由于緊張其安全性，至今仍未被同意使用。俄羅斯是現(xiàn)在全球唯一人流感冷適應流感弱毒疫苗獲準使用的國家，該疫苗己在數(shù)億小朋友中使用，證明能提供良好的保護，并無不良反映。到現(xiàn)在為止，無論俄羅斯還是全球，沒有流感病毒擴散的跡象[34，35]，但活的AIV疫苗病毒仍有與人類共感染毒株發(fā)生基因重組，或毒力返強，造成新的流感毒株出現(xiàn)的可能，對其大面積的推廣使用，還需在生物安全性方面加以時間上的驗證。7復制缺點型流感病毒疫苗用反向遺傳系統(tǒng)可獲得減毒的AIV，在流感流行時對疫苗的供應可能會起很核心的作用。病毒的HA和NA基因被克隆并插入到質粒中，通過去除HA的多個堿性氨基酸裂解位點序列使其減毒，插入了HA和NA的質粒與攜帶A/PR8/34病毒內部基因的質粒共轉染細胞系產生對應的非致病性疫苗株。采用該辦法產生的疫苗不僅能產生保護性抗體，并且能誘導很強的細胞免疫，是另一種很有發(fā)展前途的活疫苗。此疫苗能夠在幾個星期內獲得，從而能應付緊急流感大流行事件來臨時疫苗的需求。Watanable等[36]運用反向遺傳學從cDNA獲得NS2蛋白缺失的病毒粒子，用其感染細胞時，能在細胞內體現(xiàn)病毒蛋白但不能形成有感染力的病毒粒子，用此辦法制成的疫苗能保護離最后1次免疫3個月后的老鼠接受10或100LD50的攻擊（9只老鼠存活8只）。其它獲得復制缺點型流感病毒疫苗的途徑是使M2基因缺失[37]。此缺失疫苗在組織培養(yǎng)物中生長良好，但在老鼠體內有限生長，因此是一潛在的活疫苗候選。即使重組減毒的H5病毒在小鼠中只含有限的神經(jīng)毒力，但其符合抱負模式的疫苗設計特點――不會致死雞胚、削弱的毒力、對模型動物含有易感性，已經(jīng)開始運用于生產，但是在疫苗生產技術被采用之前仍有某些規(guī)章，安全性以及正當性問題需要考慮和克服。在生產人用疫苗時用于轉染的哺乳動物細胞系（如vero細胞）的質量必須符合原則。用反向遺傳系統(tǒng)產生的病毒可能被認為是“基因改良的有機體”，因此各個國家強加了某些地方和民眾的安全性法則限制其研究和發(fā)展，并且高科技的反向遺傳技術的使用權被保存，需要通過許可才干采用此辦法生產商業(yè)化疫苗。8表位疫苗根據(jù)病毒的抗原表位來研制表位疫苗，特別是為易變異的病毒疫苗的研制提供了方向。Levi等[38]將流感病毒的3個表位：Ｂ細胞表位HA91-108、CTL表位NP147-158、Th細胞表位NP55-69分別插入沙門氏菌的鞭毛蛋白基因中構建了3個真核體現(xiàn)質粒，鼻腔免疫小鼠。3種質?；旌厦庖呓M能夠誘導長久的免疫應答，并且能夠完全抵抗病毒的致死性攻擊。Thomson等[39]以1個真核體現(xiàn)質粒投遞了10個CTL抗原表位，其中涉及NP基因的3個表位：NP50-58、NP147-155、NP366-374和NS1基因的1個表位NS1152-160，免疫鼠后通過Cr51釋放實驗，檢測這些表位顯示該質粒誘導了強的CTL應答，并且能夠去除感染的病毒。表位疫苗不僅提供了一種更有效地運用病原體中各個抗原成分的辦法，并且對于流感病毒這種高度變異的病毒來說，首先能夠通過選擇含有交叉保護性的表位來達成防止多個毒株的目的，另首先能夠通過對流行毒株的監(jiān)測來及時合成表位，實現(xiàn)對變異毒株的控制。本文為全文原貌未安裝PDF瀏覽器顧客請先下載安裝原版全文9轉基因植物疫苗宋長征等運用轉基因馬鈴薯體現(xiàn)AIVHA蛋白[40]。運用電擊穿孔轉化法，將含有AIVHA基因的體現(xiàn)質粒pHAO（其中含35S啟動子和來源于大豆植物存儲蛋白基因的vspB終止末端，另有抗性標記）導入農桿菌EHA105，轉化細菌再感染馬鈴薯的幼莖外植體，轉化植株再生和溫室栽培。Westernblot分析表明，83%的轉化植株在其馬鈴薯塊莖組織中體現(xiàn)了重組HA，體現(xiàn)量占總蛋白量的0.03%～0.04%。成果顯示，用轉基因馬鈴薯生產口服AIV疫苗是有前景的。10參考文獻[1]IlariaCapua，StefanoMarangon.VaccinationforavianinfluenzainAsia[J].Vaccine，（22）：4137-4138.[2]JamesMarkSimmerman，PraneeThawatsupha，DarikaKingnatec，etal.InfluenzainThailand：acasestudyformiddleincomecountries[J].Vaccine，（23）：182-187.[3]唐秀英，田國斌，于康震，等.禽流感油乳劑滅活苗的研究[J].中國防止獸醫(yī)學報.1999，21（6）：401-405.[4]DLSuarez，SSchultz-Cherry.Immunologyofavianinfluenzavirus：areview[J].Developmental&ComparativeImmunology.，24（2-3）：269-283.[5]FURMINGERIGS.Vaccineproduction[M]∥NICHOLSONKG，WEBSCERRG，HAYAJ，etal.Thetextbookofinfluenza.Oxford：Blackwell，1998：325-332.[6]陳全嬌，金梅林，陳煥春.禽流感疫苗研究進展[J].中國生物工程雜志，，24（4）：34-38.[7]KODIHALLIS，SIVANANDANV，NAGARAJAKV，etal.Atypespecificavianinfluenzavirussubunitvaccineforturkeys：inductionofprotectiveimmunitytochallengeinfection[J].Vaccine，1994（15）：1467-1472.[8]CRAWFORDJ，WILKINSONB，VOSNESENSKYA，etal.Baculovirus-derivedhemagglutininvaccinesprotectagainstlethalinfluenzainfectionsbyavianH5andH7subtypes[J].Vaccine，1999，17（18）：2265-2274.[9]MOSSE.Geneticallyengineeredpoxvirusesforrecombinantgeneexpression，vaccination，andsafety[J].PNAS，1996（93）：11341-11348.[10]BOYLEDB，HEINEHG.Recombinantfowlpoxvirusvaccinesforpoultry[J].ImmunolCellBiol，1993，71（5）：391-397.[11]BOYLEDB，COUPARBE.Constructionofrecombinantfowlpoxvirusesasvectorsforpoultryvaccines[J].VirusRes，1988，10（4）：343-356.[12]KAWAOKAY，NAEVECW，WEBSTERRG.IsvirulenceofH5N2influenzavirusesinchickensassociatedwithlossofcarbohydratefromthehemagglutinin?[J].Virology，1984，139（2）：303-316.[13]冀德君，劉紅旗，彭大新，等.H9亞型禽流感重組雞痘病毒疫苗的免疫保護實驗[J].揚州大學學報，，23（2）：13-16.[14]程堅，劉秀梵，彭大新，等.體現(xiàn)H9亞型禽流感病毒血凝素基因的重組雞痘病毒及其免疫效力[J].微生物學報，，42（4）：442-447.[15]賈立軍，彭大新，張艷梅，等.H5亞型禽流感重組雞痘病毒活載體疫苗的構建及其遺傳穩(wěn)定性與免疫效力[J].微生物學報，，43（6）：722-727.[16]陳平，陳素娟，彭大新，等.高效體現(xiàn)H9亞型禽流感病毒HA基因的重組雞痘病毒的構建及免疫效力實驗[J].中國獸醫(yī)學報，，24（3）：216-218.[17]SWAYNEDE，GARCIAM，BECKJR，etal.ProtectionagainstdiversehighlypathogenicH5avianinfluenzavirusinchickensimmunizedwitharecombinantfowlpoxvaccinecontaininganH5avianinfluenzahemagglutiningeneinsert[J].Vaccine，（18）：1088-1095.[18]ULMERJB，DONNELLYJJ，PARKERSE，etal.HeterologousprotectionagainstinfluenzabyinjectionofDNAencodingaviralprotein[J].Science，1993（259）：1745-1749.[19]PERTRNERTM，ORANAE，MOSERJM，etal.DNAvaccinesforinfluenzavirus：differentialeffectsofmaternalantibodyonimmuneresponsestohemagglutininandnucleoprotein[J].Jvirol，（74）：7787-7793.[20]陳化蘭，于康震，田國斌，等.禽流感病毒血凝素基因的克隆及其DNA疫苗的免疫原性[J].中國獸醫(yī)學報，1997，17（6）：555-558.[21]KODIHALLIS，GOTOH，KOBASADL，etal.DNAvaccineencodinghemagglutininprovidesprotectiveimmunityagainstH5N1influenzavirusinfectioninmice[J].JVirol，1999，73（3）：2094?2098.本文為全文原貌未安裝PDF瀏覽器顧客請先下載安裝原版全文[22]MITCHELLJA，GREENTD，BRIGHTRA，etal.InductionofheterosubtypicimmunitytoinfluenzaAvirususingaDNAvaccineexpressinghemagglutinin-C3dfusionproteins[J].Vaccine，，21（9-10）：902-914.[23]EPSTEINSL，TUMPEYTM，MISPLONJA，etal.DNAvaccineexpressingconservedinfluenzavirusproteinsprotectiveagainstH5N1challengeinfectioninmice[J].EmergInfectDis，，8（8）：796-801.[24]ULMERJB.Influe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