cd14與lr4在lps膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的相互作用

cd14與lr4在lps膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的相互作用

lc（lc）是革蘭氏陰性細(xì)胞外膜的主要組成部分，也是免疫反應(yīng)細(xì)胞的強(qiáng)大激生劑。這是革蘭氏陰性疾病的主要病因。有關(guān)LPS激活免疫細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制一直是免疫分子識(shí)別、炎癥反應(yīng)和創(chuàng)傷外科領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)和難點(diǎn)。但至今未能完全闡明。研究表明,CD14是LPS的受體,參與LPS的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),在介導(dǎo)LPS的病理生理效應(yīng)中具有重要的作用。它是一種GPI膜錨定蛋白,缺乏跨膜區(qū)和胞內(nèi)結(jié)構(gòu),不能將胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至胞內(nèi)。由此提示在細(xì)胞膜上肯定存在LPS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的“共受體”。TLR4(toll-likereceptor4)的發(fā)現(xiàn)和研究為該領(lǐng)域的研究帶來了新的曙光。TLR4是TLRs中的成員之一,屬IL-1R(interleukin-1receptor)超家族。它是一種胞外區(qū)富含亮氨酸重復(fù)序列、胞內(nèi)區(qū)與IL-1受體同源的跨膜受體,具有IL-1R超家族的典型結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。研究證實(shí),TLR4是哺乳動(dòng)物L(fēng)PS的受體和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子,在介導(dǎo)LPS的病理生理效應(yīng)中具有重要作用。那么,TLR4是否為CD14的共受體?它們?cè)诮閷?dǎo)LPS的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中作用模式怎樣?既然TLR4是一種跨膜受體,LPS的信號(hào)是否通過CD14與TLR4間的相互作用將胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至胞內(nèi)的?這些問題均未闡明。酵母雙雜合系統(tǒng)是近些年來發(fā)展起來的一種用于研究蛋白質(zhì)之間相互作用的新型生物學(xué)技術(shù)。該系統(tǒng)可用于研究?jī)蓚€(gè)已知蛋白質(zhì)之間的相互作用。為此,本研究擬利用PCR克隆CD14cDNA和TLR4胞外區(qū)cDNA,并構(gòu)建相應(yīng)的酵母表達(dá)載體,后利用酵母雙雜交系統(tǒng)研究CD14與TLR4間是否存在相互作用。同時(shí),在體內(nèi)外行免疫共沉淀及Pull-down實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證CD14與TLR4間的相互作用,本實(shí)驗(yàn)的實(shí)施將為進(jìn)一步闡明LPS的膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制提供新的理論依據(jù),也為革蘭陰性菌膿毒癥的防治提供新手段。1材料和方法1.1tlr4cdna質(zhì)料質(zhì)粒pcDNA3/HuCD14由美國(guó)Eisai研究所楊樺博士提供,人TLR4cDNA質(zhì)料由意大利MarioNegri研究所MartaMuzio教授提供。大腸桿菌DH5α由本室保存。酵母雙雜交系統(tǒng)為CLONTECH公司產(chǎn)品。1.2his和iggs的表達(dá)pGEM-T載體購自Promega公司,PCR試劑盒、內(nèi)切酶和T4DNA連接試劑盒購自Takara公司。兔抗-His多克隆抗體和羊抗兔IgGs抗體購自SantaCruz公司。pGEX-4T-1,T-vector試劑盒和免疫沉淀分析全套試劑盒購自Clonetech公司。pET-16b-CD14表達(dá)載體與His以及GST-TRL4和His-CD14融合蛋白由本實(shí)驗(yàn)室表達(dá)。其余生化試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。1.3pcr擴(kuò)增環(huán)境根據(jù)人CD14和TLR4胞外區(qū)DNA序列,并分別去掉二者信號(hào)肽部分的堿基序列。設(shè)計(jì)如下引物:上游引物P1:5′-CGGGATCCACCCACGCCAGAACCTTGTGAG-3′;上游引物P2:5′-GGAATTCCATATGGAGCTGAATTTCTAC-3′;下游引物P3:5′-GGAATTCCTGTCTTGGATCTTAGGCAAAGC-3′;下游引物P4:5′-GGGATCCTTAGATATTCAAACTCAGCAC-3′。其中P1和P3擴(kuò)增CD14cDNA,上下游引物中分別導(dǎo)入EcoRⅠ、BamHⅠ酶切位點(diǎn),同時(shí)加上相應(yīng)的保護(hù)堿基。P2和P4擴(kuò)增TLR4胞外區(qū)cDNA,在上下游引物中分別引入NdeⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn),同時(shí)加上相應(yīng)的保護(hù)堿基。分別以質(zhì)粒pcDNA3/HuCD14和TLR4cDNA質(zhì)粒為模板,進(jìn)行PCR反應(yīng),條件為:94℃變性5min后,進(jìn)入30個(gè)循環(huán):94℃,30s;60℃,50s;72℃,1.5min,最后72℃延伸10min,4℃保存。1.4pgadt7ad-cd14和pgbkt7bk3質(zhì)粒的構(gòu)建將上述PCR產(chǎn)物分別插入pGEM-T載體,轉(zhuǎn)化宿主菌DH5ɑ,提取質(zhì)粒后,分別以EcoRⅠ、BamHⅠ和NdeⅠ和BamHⅠ酶切,回收相應(yīng)片段,分別插入pGADT7AD和pGBKT7BD相同的位點(diǎn),構(gòu)建成pGADT7AD-CD14和pGBKT7BD-TLR4質(zhì)粒,并進(jìn)行酶切和DNA測(cè)序鑒定。1.5生長(zhǎng)性狀測(cè)定制備酵母菌Y187感受態(tài),取出100μ1與待檢測(cè)的質(zhì)粒DNA各5～10μg混合,轉(zhuǎn)入0.2cm的電轉(zhuǎn)杯,冰浴5min,于Bio-RadGenePulser電轉(zhuǎn)儀1500V,25μF,200Ω條件下電轉(zhuǎn)化,立即加入1ml冰浴山梨醇,將菌液分別涂布相應(yīng)的SD(營(yíng)養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基)平板上,30℃溫育3～5d,觀察轉(zhuǎn)化菌的生長(zhǎng)。1.6u3000eql回復(fù)合醇液的制備待平板上克隆培養(yǎng)至直徑2～3mm時(shí),刮取單個(gè)克隆菌落直接涂到濾紙上,將濾紙移入液氮池中冷凍1min,室溫下解凍,置于另一張預(yù)先在Z緩沖液/X-gal溶液[100mlZ緩沖液(Na2HPO4·7H2O16.1g/L,NaHPO4·2H2O5.5g/L,KCl0.75g/L,MgSO4·7H2O0.246g/L,pH7.0),0.27mlβ-巰基乙醇,1.67mlX-gal儲(chǔ)存液]中浸泡過的濾紙上,室溫溫育直至出現(xiàn)藍(lán)色克隆。1.7抗his抗體將本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建的GST-TLR4和His-CD14融合蛋白的原核表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化入DH5α大腸桿菌,IPTG誘導(dǎo)表達(dá),離心收集細(xì)菌,PBS重懸,超聲破菌。將包被有抗GST抗體的瓊脂糖4B膠頭加入到GST-TLR4的細(xì)胞裂解液中混勻,離心收集膠頭,冰浴PBS液洗滌后,加入K-IBP緩沖液(142.5mmol/LKCl,5mmol/LMgCl2,10mmol/LHEPES,1mmol/LEDTA,0.2%NP-40),后加入His-CD14的細(xì)胞裂解液,同時(shí)以Histagp27Kipl作陰性對(duì)照,12℃孵浴2h,K-IBP緩沖液洗滌,離心后加PBS重懸,煮沸2～3min,離心,上清行SDS,PAGE轉(zhuǎn)膜后用抗His抗體行Westernblot。1.8mv-ha質(zhì)粒TLR4胞外區(qū)cDNA和CD14cDNA分別亞克隆進(jìn)入pCMV-MYC和pCMV-HA質(zhì)粒,制成融合表達(dá)載體:pCMV-MYC-TLR4和pCMV-HA-CD14,然后將這兩個(gè)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染進(jìn)HEK-293細(xì)胞。利用抗-HA和抗-MYC單克隆抗體按照Clonetech公司提供的操作指導(dǎo)行免疫共沉淀分析測(cè)試。2結(jié)果2.1cd14cda的大小PCR產(chǎn)物分別取2μl作1.5%瓊脂糖凝膠電泳,結(jié)果顯示:在約1.1kb處有一明亮的條帶,這與設(shè)計(jì)的CD14cDNA的大小相一致。在約1.8kb處有一明亮的條帶,這與設(shè)計(jì)的TLR4胞外區(qū)cDNA的大小相一致。2.2重組質(zhì)粒的鑒定構(gòu)建的pGADT7AD-CD14和pGBKT7BD-TLR4重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α后,提取質(zhì)粒,酶切鑒定表明,重組質(zhì)粒能夠切出大小與PCR產(chǎn)物相一致的DNA片段。測(cè)序結(jié)果表明,pGADT7AD-CD14和pGBKT7BD-TLR4重組質(zhì)粒中CD14和TLR4的閱讀框和序列完全正確,酵母表達(dá)載體構(gòu)建成功。2.3酵母菌中tlr4的表達(dá)按標(biāo)準(zhǔn)的酵母雙雜交系統(tǒng)說明書的方法,分別檢測(cè)了pGADT7AD-CD14和pGBKT7BD-TLR4質(zhì)粒的自主激活酵母菌Y187報(bào)告基因LacZ的能力和TLR4與CD14間的相互作用。結(jié)果顯示,單獨(dú)將pGADT7AD-CD14或pGBKT7BD-TLR4分別轉(zhuǎn)化酵母菌Y187均不能激活報(bào)告基因LacZ的表達(dá),克隆為白色,無自主激活報(bào)告基因表達(dá)的能力。另外,pGADT7AD-CD14與pGBKT7BD、pGBKT7BD-TLR4與pGADT7AD共轉(zhuǎn)化酵母菌Y187也不能激活報(bào)告基因LacZ的表達(dá),克隆為白色,說明TLR4與AD、CD14與BD間不發(fā)生相互作用。而pGADT7AD-CD14和pGBKT7BD-TLR4共轉(zhuǎn)化時(shí),能夠激活報(bào)告基因LacZ的表達(dá),克隆為藍(lán)色,結(jié)果與陽性對(duì)照一致(表1),提示CD14與TLR4之間發(fā)生相互作用。2.4his-cd14的降解Westernblot結(jié)果顯示,在體外,GST-TLR4胞外結(jié)構(gòu)域能與His-CD14相互作用,包被有抗GST抗體的瓊脂糖4B膠頭能夠吸附GST-TLR4融合蛋白,通過TLR4和CD14的相互作用,間接地將His-CD14吸附下來。相反,膠頭則不吸附His-p27kipl(圖1)。2.5免疫沉淀試驗(yàn)為了更進(jìn)一步地確定TLR4與CD14在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)是否存在交互作用,將pCMV-MYC-TLR4和pCMV-HA-CD14質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染進(jìn)HEK-293細(xì)胞后,破碎細(xì)胞抽提裂解物與抗-HA抗體行免疫沉淀試驗(yàn),隨后用抗-MYC抗體實(shí)施Westernblot測(cè)定,同時(shí)用未插入質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染細(xì)胞提取物做對(duì)照。結(jié)果顯示:在經(jīng)抗--HA抗體沉淀的蛋白中發(fā)現(xiàn)了MYC-TLR4,表明TLR4與CD14在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)存在交互作用(圖2)。3cd14與tlr4共轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的構(gòu)建酵母雙雜交技術(shù)是一項(xiàng)新興的分子生物學(xué)新技術(shù),自從Fields和Song發(fā)現(xiàn)以來,這一研究蛋白質(zhì)間相互作用的新技術(shù)得到了廣泛的應(yīng)用。其基本原理為:真核細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄激活因子的轉(zhuǎn)錄激活作用是由功能相對(duì)獨(dú)立的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(bindingdomain,BD)和轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域(activationdomain,AD)共同完成的,這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域通過共價(jià)或非共價(jià)連接建立的空間聯(lián)系是轉(zhuǎn)錄因子激活靶基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵。根據(jù)這一特點(diǎn),如果將可能存在相互作用的兩種蛋白X和Y分別與BD和AD以雜合蛋白的形式在酵母中共表達(dá)并分布于細(xì)胞核中,X和Y之間的相互作用就可以將BD和AD在空間結(jié)構(gòu)上重新連接為一個(gè)整體,進(jìn)而激活報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。與其他研究蛋白相互作用的方法相比,具有高靈敏度、能在真核生物水平模擬蛋白間的作用、相對(duì)簡(jiǎn)便、快速。因此,該技術(shù)已在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期與分化、基因表達(dá)調(diào)控及蛋白質(zhì)自身特性等方面的研究得到廣泛運(yùn)用。為了證實(shí)CD14與TLR4之間的相互作用,本實(shí)驗(yàn)首先將CD14與AD融合、TLR4與BD融合構(gòu)建酵母表達(dá)載體。另外,在本實(shí)驗(yàn)中為減少靶蛋白對(duì)酵母菌的毒性,而且TLR4屬于跨膜蛋白,能與CD14發(fā)生相互作用只能是其胞外區(qū),因此我們?cè)跇?gòu)建載體TLR4-BD融合表達(dá)載體時(shí),只選用了TLR4的胞外區(qū)蛋白。結(jié)果顯示,CD14或TLR4單獨(dú)轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞以及CD14與BD、TLR4與AD載體共轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞均不能激活LacZ報(bào)告基因的表達(dá),而CD14和TLR4共轉(zhuǎn)化時(shí),則可激活報(bào)告基因LacZ的表達(dá),說明在酵母系統(tǒng)中CD14與TLR4之間存在相互作用。但值得注意的是,酵母雙雜交存在假陽性較高等缺點(diǎn),為此我們進(jìn)一步應(yīng)用GSTPull-down實(shí)驗(yàn)和免疫共沉淀分析實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證CD14與TLR4之間的相互作用。結(jié)果也顯示,在體外反應(yīng)體系和哺乳類細(xì)胞(HEK293)中,CD14與TLR4之間存在相互作用。至于這種相互作用的強(qiáng)弱程度會(huì)不會(huì)受外界因素的影響?二者相互作用的結(jié)構(gòu)域如何?我們將作進(jìn)一步研究。關(guān)于LPS膜受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子機(jī)制,一直是研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。Ulevitch等提出了一套完整的學(xué)說,認(rèn)為L(zhǎng)PS首先與LPS結(jié)合蛋白(LPSbindingprotein,LBP)、CD14形成LPS-LBP-CD14復(fù)合物,再通過跨膜分子將信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)。CD14與多種跨膜信號(hào)受體不同,缺乏跨膜和胞內(nèi)區(qū),不能直接將信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)。目前認(rèn)為,LPS受體屬于“多構(gòu)件受體”,包含至少兩種以上的蛋白。CD14是主要的配基結(jié)合構(gòu)件,其他蛋白介導(dǎo)LPS和CD14結(jié)合后的跨膜信號(hào)。既然TLR4是LPS的跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子,那么它們之間的關(guān)系和作用模式怎樣?我們認(rèn)為可能有兩種不同模式:第一種假設(shè)為TLR4不直接和LPS結(jié)合,LPS與CD14結(jié)合后,通過與其相互作用(直接/間接)使構(gòu)形發(fā)生改變,將信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi);另一種為CD14使LPS直接與TLR4結(jié)合,起“聚集和傳遞”LPS的作用。研究表明LPS刺激細(xì)胞后,CD14與TLR4均表達(dá)增加,而且CD14明顯可調(diào)TLR4介導(dǎo)LPS對(duì)細(xì)胞NF-kB的激活效應(yīng)。Jiang等利用能量共振轉(zhuǎn)移技術(shù)研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞在LPS作用后,CD14與TLR4相互接近,產(chǎn)生能量淬滅,這些均提示CD14與TLR4間可能存在相互作用。CD14與TLR4的胞外區(qū)均含有亮氨酸多重復(fù)序列,這些區(qū)域可能在二者蛋白相互作用中具有重要作用。但都沒有直接的證據(jù)來證實(shí)。本研究首次運(yùn)用酵母雙雜交技術(shù)、Pull-down實(shí)驗(yàn)和免疫共沉淀測(cè)試分析方法初步證實(shí)CD14與TLR4確實(shí)存在相互作用,為上述