轉基因技術在草坪草改良中的應用

轉基因技術在草坪草改良中的應用

傳統(tǒng)的草坪業(yè)在過去40年中取得了巨大的發(fā)展。經(jīng)過遺傳特性的選擇和重組,培育了大量的冷季型和暖季型草坪草。大約有40個草種已被用于草坪的建植,在不同的氣候和土壤條件下美化我們的世界、豐富人類的多種需求。民居環(huán)境、城鄉(xiāng)公共綠地、園林景區(qū)、高爾夫球場、運動場,乃至機場、公路堤岸等草坪都是十分重要的生態(tài)環(huán)境組成部分。在美國,草坪草草籽每年銷量達5.8億美元,僅次于玉米雜交種的銷售額,草坪業(yè)已成為一個十分重要的經(jīng)濟行業(yè)。對草坪需求的增長和草坪草生境的變化,使國際草坪育種工作者紛紛提出,使用高新生物技術向草坪草引入新的遺傳特性來創(chuàng)造新的草坪草品種。1998年《草坪草的生物技術》(TurfgrassBiotachnology)一書問世,書中比較全面地論述了從細胞水平和分子水平的技術運用來改良草坪草。近年來擬南芥、水稻等植物基因組的研究進展十分迅速,大量的功能基因被發(fā)現(xiàn),并大大推動了植物基因工程的發(fā)展。在草坪草的研究中,一些重要草坪草植株的再生技術和遺傳轉化技術取得了長足的進步。分子標記的輔助育種也展示了可喜的苗頭[8,9,10,11,12,13,14,15,16]。1植物基因型的轉化許多草坪草是單子葉植物,其離體的再生系統(tǒng)建立比較困難,成熟的和已分化的組織難以產(chǎn)生具有再生潛力的細胞團。Vasil綜合前人的研究成果提出了建立草類再生系統(tǒng)的3個要點:1)選擇成熟胚的分生組織、葉基分生組織和幼穗分生組織作為外植體來誘導具植株再生潛能的細胞系;2)高濃度的生長素類物質,如2,4-D和3,6二氯-O-茴香酸來誘導愈傷組織;3)從胚性愈傷組織制備原生質體或其他再生系統(tǒng)。迄今為止,這3個要點仍然是草坪草基因改良的重要技術基礎。Dale首先從未成熟的意大利黑麥草Loliummultiflorum獲得可進行胚性培育的細胞系,Chai和Sticklen概括了此前的重要進展。資料表明,黑麥草屬、羊茅屬Festuca、剪股穎屬Agrostis、早熟禾屬Poa、鴨茅屬Dactylis、鈍葉草屬Stenotaphrum、狗牙根屬Cynodon、蜈草屬Eremochloa﹑雀稗屬Paspalum、野牛草屬Buchlo?﹑結縷草屬Zoysia等重要的屬種中,已有成功的再生體系,并找到從原生質體再生出植株的方法。這些工作為草類植物導入基因創(chuàng)造了必要的前提條件。莖端再生系統(tǒng)建立之后,轉化技術仍有許多困難,在轉化過程中,由于在培養(yǎng)基中施加了選擇壓力,大大限制了芽的分化和再生。一些學者觀察到草坪草組培過程中可能發(fā)生的基因型變異,這在其他種屬的植物培養(yǎng)中也常遇見。這種變化在冷季型草類中更多一些。因為實際上的冷季型草類在遺傳上是一種異質體(heterogeneous),這種變異因素在遺傳轉化研究中應充分考慮。在草坪草轉化過程中,曾發(fā)現(xiàn)個別株系生長變得十分迅速,它雖不適于做草坪草,但這種性狀的變化適合牧草(見彩插后頁圖1)。2胚性愈傷組織的誘導表達Horn等人首次報道了轉基因的鴨茅D.glomerata,Lee報道了6種冷季型草坪草轉化成功。被導入的外源基因均是供轉化選擇的標記基因和報告基因,其中包括報告基因Gus,抗除草劑基因草丁膦乙酰轉化酶基因(phosphinothricinacetyltransferase基因,即Bar基因)和潮霉素磷酸轉移酶(hygromycinphosphotransferase)基因。這些工作對優(yōu)化轉基因的程序十分重要。DNA直接導入植物細胞的方法:1)選擇成熟胚的分生組織、葉基分生組織和幼穗分生組織作為外植體來誘導具植株再生潛能的細胞系;2)高濃度的生長素類物質,如2,4-D和3,6二氯-O-茴香酸來誘導愈傷組織;3)從胚性愈傷組織制備原生質體或其他再生系統(tǒng)。包括借助電激作用或聚乙二醇的介導,將DNA直接引入原生質體,還包括基因槍法[42,43,44,45,46,47,48]和碳化硅(siliconcarlide)纖維介導方法對草坪草胚性愈傷組織的轉化。據(jù)在黑麥草、高羊茅、早熟禾、紫羊茅中的實踐,認為在獲得良好胚性愈傷組織的基礎上,采用基因槍轉化方法,轉化頻率還是比較高。圖2(見彩插后頁圖2)是在實驗室進行的對黑麥草的遺傳轉化和植株再生的過程。農(nóng)桿菌介導的轉化方法具有簡便和導入拷貝數(shù)低等優(yōu)點,近年由于農(nóng)桿菌介導方法在水稻、玉米、小麥等單子葉作物的轉化中得到較多的改良和實際應用,因此,草類轉化中的農(nóng)桿菌介導方法也將得到比較廣泛的應用。3抗rondup基因在草坪草方面的應用早期的工作主要是利用一些標記基因或報告基因來轉化草坪草。這些工作使外源DNA整合到草坪草基因組中的技術趨于完善。Edminster指出,雖然至今尚無轉基因的草坪草進入商業(yè)化生產(chǎn),但有必要加速轉基因草坪草的商業(yè)化進程,其理由是:在經(jīng)營和養(yǎng)護草坪草的過程中,濫用殺蟲劑對環(huán)境破壞令人擔憂。獲得抗蟲的、抗除莠劑的草坪草在技術上已經(jīng)成熟,能夠使用更少或更安全的農(nóng)藥。這種對環(huán)境的友好將使草坪草種子市場回報增加10億美元以上。并列舉了抗RoundUP的草坪草及其他抗蟲、抗真菌病、抗病毒病的草坪草,以及耐受多種環(huán)境脅迫的轉基因技術,如抗干旱、抗低溫、耐鹽堿、耐金屬污染等。一些學者指出,生物技術提供了強有力的武器來解決草坪草改良的技術關鍵,認為在水稻、小麥、大麥、小米、甘薯等農(nóng)作物上行之有效的抗除草劑、抗旱、抗寒、抗蟲、抗真菌病、抗細菌病的基因可以直接用于草坪草的改良[60,61,62,63,64,65]。用于水稻、小麥矮化的控制赤霉素活性的基因,對于促進草坪草的矮化和蓮座式生長都是可行的。例如,改變膜類脂成分以提高植物耐寒性的研究結果也已被用于培育耐寒草坪草。日本生物技術安全部列舉該國轉基因植物現(xiàn)狀時提到,日本草坪草公司將幾丁質酶基因導入小糠草和將β-1,3-葡聚糖酶基因導入結縷草獲得2種抗真菌的草坪草。實驗室在研究耐旱、耐寒基因的基礎上,將一些基因導入黑麥草、高羊茅、早熟禾和紫羊茅等草坪草,獲得了耐旱、耐寒性提高的株系。目前,已有多個轉基因品系獲準進入中間實驗和環(huán)境釋放。圖3,4,6(見彩插后頁圖3,4,6)及圖5顯示了部分轉基因草坪草的田間表現(xiàn)。這里特別提到自然界中一些草類的花粉含有引發(fā)過敏性疾病(花粉癥、枯草熟等)的致敏源。利用反義變應原基因導入草類植物,可以阻斷致敏源的表達。例如,含有致敏源Lo1P5的反義DNA導入黑麥草后,可以大幅度降低花粉的致敏性。隨著社會進步和需求的增長,一些基因修飾的新型草坪草品種將引入試驗。這對改善環(huán)境的裨益以及其所表現(xiàn)的生物安全性將會受到社會的廣泛歡迎。4抗雜草基因轉移和種植轉基因草類的生物安全性問題主要是花粉途徑的基因漂移是否會引發(fā)潛在的生態(tài)安全。在城市綠地和運動場所中的草坪草通常要依靠修剪來養(yǎng)護,不使其開花結實。因此,在人居環(huán)境中一般不會出現(xiàn)基因逃逸(geneescape)現(xiàn)象。Wipff及其同事設計了多種方案來探索在自然群體中transgene向野生草類漂移的可能性。大多數(shù)草坪草自交傳粉,異交率甚低,而且穎殼開放時間短,種屬間雜交的情況很少。盡管如此,研究者認為,要十分關注抗除草劑基因向野生雜草轉移的可能性。一些研究者已提出,培