NLRP3炎性小體在抑郁癥與糖尿病共病中的作用及其機制研究

NLRP3炎性小體在抑郁癥與糖尿病共病中的作用及其機制研究研究背景與目的:隨著經(jīng)濟發(fā)展日趨迅猛、社會變革不斷深化以及生活節(jié)奏顯著加快,現(xiàn)代人類所承載的壓力和挑戰(zhàn)空前強大。長期、慢性的應激暴露會給人們的身心健康帶來巨大威脅,引發(fā)心血管、代謝、消化以及神經(jīng)精神系統(tǒng)的多種慢性疾病。慢性非傳染性疾病已經(jīng)成為構成全球疾病負擔的主要因素。最近的全球疾病負擔研究（Globalburdenofdisease,GBD）榜單中,抑郁障礙和糖尿病高居第三和第四（僅次于未區(qū)分病因的腰痛與頭痛）;在中國,二者則名列第二和第六,且仍呈逐年攀升態(tài)勢。更緊迫的是,這兩類疾病存在高度共病,嚴重影響患者的診療進程和生活質量。近年來,關于二者之間關聯(lián)的討論與研究,已然成為了領域內的關注熱點,但目前機制仍不明確。系列研究表明,慢性低活度炎癥反應是多種慢性疾病發(fā)生發(fā)展的共同通路,包括IL-1β（Interleukin-1β）在內的多種炎性細胞因子在其中扮演了重要角色。據(jù)報道,IL-1β可以通過內質網(wǎng)應激、線粒體應激等多種途徑損傷胰島B細胞,導致后者壞死及凋亡,胰島素分泌減少。再者,IL-1β還能通過促進IRS1（Insulinreceptorsubstrate1）蛋白絲氨酸磷酸化,在脂肪組織、肝臟等重要代謝靶器官中誘發(fā)胰島素抵抗,由此參與T1DM和T2DM（Type1/2DiabetesMellitus）的發(fā)病機制。此外,IL-1β等促炎細胞因子也可以通過激活HPA（Hypothalamic-pituitary-adrenal）軸、擾亂犬尿氨酸代謝通路、促進谷氨酸興奮毒性以及影響神經(jīng)可塑性等途徑,從而參與抑郁癥的發(fā)生和發(fā)展。臨床研究還證實,抑郁癥患者較健康志愿者血液和腦脊液IL-1β含量升高,且抗抑郁藥物可使其顯著降低。實際上,IL-1β的成熟活化需要經(jīng)過特異性轉化酶（Caspase-1）的剪切,而后者是構成炎性小體復合結構的關鍵組分。在炎性小體的眾多類型中,NLRP3（NACHT,LRRandPYDdomains-containingprotein3）炎性小體較為重要,在固有免疫系統(tǒng)中發(fā)揮抗感染的作用。然而,如其被過度激活,可能會引發(fā)系統(tǒng)性炎癥級聯(lián)反應,從而導致疾病的發(fā)生。最近的研究表明,糖尿病患者和抑郁癥患者的循環(huán)血免疫細胞中均發(fā)現(xiàn)了NLRP3炎性小體的高表達。包括本課題組在內的更進一步的研究發(fā)現(xiàn),糖皮質激素、高血糖、高血脂等應激或代謝危險信號能夠激活NLRP3炎性小體。這不禁引發(fā)了我們的思考:以NLRP3炎性小體激活為核心的慢性低活度炎癥反應,可能正是抑郁癥、糖尿病等應激、代謝疾病之間聯(lián)系的關鍵樞紐。為驗證這一推測,我們力求在動物和細胞實驗中闡明抑郁癥與糖尿病共病的具體機制,并據(jù)此提供防治靶點,預期結果將為抑郁癥與糖尿病的診療貢獻新思路,對研發(fā)針對性藥物、探索高效防治策略、減輕疾病負擔具有重要的社會意義和經(jīng)濟價值。研究方法:（一）慢性應激誘發(fā)小鼠抑郁樣行為及NLRP3炎性小體的作用采用為期12周的慢性應激（本課題為慢性不可預見性輕度應激,CUMS）構建小鼠抑郁模型,測定血清皮質酮及炎性因子水平;應用炎性小體抑制劑格列本脲及抗抑郁藥物氟西汀進行干預,觀察小鼠行為學及炎癥指標改善情況;隨后檢測模型小鼠海馬區(qū)膠質細胞激活情況;最后,檢測海馬區(qū)NLRP3炎性小體的激活及其可能機制。（二）抑郁模型小鼠共病糖代謝紊亂及NLRP3炎性小體的作用檢測抑郁模型小鼠的多項糖代謝指標,評估胰島素抵抗及胰島分泌功能;檢測海馬組織的胰島素信號通路;觀察胰島組織的結構和功能,分析異常的可能原因,并進一步檢測胰島組織中炎癥細胞的浸潤情況;對比海馬區(qū)的活化機制,檢測胰腺組織NLRP3炎性小體的表達與激活情況。（三）高糖環(huán)境激活小鼠NLRP3炎性小體在體外構建高濃度葡萄糖環(huán)境,觀察小鼠小膠質細胞（BV-2）NLRP3炎性小體的激活情況;隨后,分別測定上游第一信號（TLR4/MyD88/NF-κB）及第二信號（ROS/PKR/P₂X₇R/TXNIP）等相關通路的激活情況,并使用特異性信號通路抑制劑進行干預,確認高糖活化炎性小體的具體機制;最后,選取目前最高效的NLRP3炎性小體特異性抑制劑MCC950,對比分析其對于高糖模型中炎性小體的抑制作用。（四）糖尿病模型小鼠共病抑郁樣行為及NLRP3炎性小體的作用通過單次大劑量腹腔注射STZ構建小鼠糖尿?。ǜ哐牵┠Ｐ?檢測模型小鼠抑郁相關行為學指標;應用MCC950對模型小鼠進行干預,并評估干預效果;測定模型小鼠血清皮質酮及炎性因子水平;最后,對小鼠海馬區(qū)膠質細胞及炎性小體激活情況進行檢測與分析。研究結果:（一）慢性應激誘發(fā)小鼠抑郁樣行為1、為期12周的慢性應激（CUMS）誘發(fā)小鼠呈現(xiàn)抑郁樣行為,給予格列本脲或氟西汀干預均能有效緩解。2、CUMS誘發(fā)小鼠HPA軸過度激活及相關炎癥反應,格列本脲可顯著改善。3、CUMS誘發(fā)海馬區(qū)小膠質細胞激活,格列本脲及氟西汀干預效果不明顯;星形膠質細胞未見明顯改變。4、CUMS可能通過上調TXNIP的表達,誘發(fā)海馬區(qū)NLRP3炎性小體活化及IL-1β產(chǎn)生,格列本脲及氟西汀均可抑制該過程。（二）抑郁模型小鼠共病糖代謝紊亂1、CUMS誘導的抑郁模型小鼠呈現(xiàn)胰島素分泌和耐量異常,空腹血胰島素濃度升高,格列本脲可減輕胰島素耐量受損。2、CUMS誘導的抑郁模型小鼠海馬區(qū)胰島素信號通路異常,AKT1磷酸化（Ser473）水平受抑制,格列本脲對此具有改善作用。3、CUMS可以降低胰島組織中胰島B細胞占比,格列本脲與氟西汀均對其有保護作用。4、CUMS促進F4/80陽性巨噬細胞在胰島組織異常聚積,格列本脲可以明顯改善。5、與中樞神經(jīng)系統(tǒng)類似,CUMS可能通過上調TXNIP,誘發(fā)胰腺組織NLRP3炎性小體活化及IL-1β產(chǎn)生,格列本脲及氟西汀干預對其均有抑制作用。（三）高糖環(huán)境激活小鼠NLRP3炎性小體1、體外高濃度葡萄糖環(huán)境（50mM）能夠激活小鼠小膠質細胞（BV-2）NLRP3炎性小體,促進IL-1β的合成與分泌,此過程不依賴于滲透壓的升高。2、體外高糖環(huán)境不依賴于經(jīng)典的TLR4/MyD88信號通路,誘發(fā)炎性小體激活第一信號關鍵分子NF-κBp65亞基磷酸化。3、NF-κB特異性抑制劑能有效阻斷高糖誘導的NLRP3炎性小體激活及IL-1β產(chǎn)生。4、體外高糖環(huán)境可以促進炎性小體激活第二信號關鍵分子ROS生成及PKR磷酸化,上調P₂X₇R及TXNIP的表達。5、PKR或P₂X₇R特異性抑制劑均可阻斷高糖誘導的NLRP3炎性小體激活及IL-1β產(chǎn)生。6、ROS清除劑可以有效抑制PKR磷酸化及TXNIP表達,并阻斷高糖誘導的NLRP3炎性小體激活及IL-1β產(chǎn)生,但不能改變P₂X₇R的表達。7、新型特異性抑制劑MCC950可以高效阻斷高糖誘導的NLRP3炎性小體激活及IL-1β產(chǎn)生。（四）糖尿病模型小鼠共病抑郁樣行為1、單次腹腔注射STZ通過損傷胰島B細胞構建小鼠糖尿?。ǜ哐牵┠Ｐ?炎性小體抑制劑MCC950對血糖影響不顯著。2、STZ誘導的高血糖模型小鼠呈現(xiàn)抑郁樣行為,MCC950可有效緩解。3、STZ誘導的高血糖模型小鼠血清IL-1β濃度升高,MCC950可顯著改善。4、STZ誘導的高血糖模型小鼠海馬區(qū)小膠質細胞激活,MCC950具有抑制作用;星形膠質細胞未見明顯異常。5、STZ誘導的高血糖模型小鼠海馬區(qū)NLRP3炎性小體激活,IL-1β表達增加,MCC950具有高效抑制作用。結論:綜上所述,慢性應激可以系統(tǒng)性激活NLRP3炎性小體,進而誘發(fā)小鼠抑郁樣行為共病糖代謝紊亂;高濃度葡萄糖環(huán)境能夠激活小膠質細胞中的NLRP3炎性