血紅蛋白的提取和分離(優(yōu)質(zhì)課)概要

1、血紅蛋白的提取和分離。分離生物大分子的基本思想：選擇一定的物理或化學(xué)方法來分離具有不同物理或化學(xué)性質(zhì)的生物大分子。蛋白質(zhì)分離和提取原理：根據(jù)蛋白質(zhì)的各種特性的不同，如分子的形狀和大小、電荷的性質(zhì)和數(shù)量、溶解度、吸附性能和對其他分子的親和力，可以分離出不同種類的蛋白質(zhì)?；A(chǔ)知識，凝膠色譜，凝膠電泳，基礎(chǔ)知識，2。凝膠：大多數(shù)凝膠是由多糖化合物(如葡聚糖或瓊脂糖)組成的多孔球體，有許多通道貫穿其中。根據(jù)待分離蛋白質(zhì)的相對分子量，用具有網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的凝膠分子篩進(jìn)行分離。1.概念：(1)凝膠色譜(分配色譜)，基礎(chǔ)知識，(1)凝膠色譜(分配色譜)，3。凝膠色譜的原理是，當(dāng)相對分子量不同的蛋白質(zhì)通過凝膠時，相

2、對分子量較小的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，距離較長，移動速度較慢；然而，相對分子量較高的蛋白質(zhì)不能進(jìn)入凝膠內(nèi)的通道，只能在凝膠外移動，距離較短，移動速度較快。因此，具有不同相對分子量的蛋白質(zhì)分子被分離。根據(jù)特征：蛋白質(zhì)分子量的大小。4。凝膠色譜分離蛋白質(zhì)的原理和具體過程，凝膠色譜分離蛋白質(zhì)的動畫演示，(2)緩沖液，1。概念：在一定范圍內(nèi)，任何能抵抗少量強酸或強堿影響并保持原溶液的酸堿度基本不變的混合溶液。能抵抗外界酸堿對溶液酸堿度的影響，保持酸堿度基本不變。2。動作：基礎(chǔ)知識，(2)緩沖溶液，基礎(chǔ)知識，3。緩沖液：的制備，通常通過將12種緩沖液溶解在水中來制備。可以通過調(diào)節(jié)緩沖液的比例來制備

3、用于不同酸堿度范圍的緩沖液。4.問題：本項目使用的緩沖區(qū)為： _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _原理：許多重要的生物大分子，如多肽和核酸，都有可解離的基團(tuán)，在一定的酸堿度下，這些基團(tuán)會帶正電荷或負(fù)電荷。在電場的作用下，這些帶電荷的分子會帶相反的電荷向電極移動。 電泳利用待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異，以及分子本身大小和形狀的差異，

4、使帶電分子具有不同的遷移速度，從而實現(xiàn)樣品中各種分子的分離?；A(chǔ)知識、影響蛋白質(zhì)分子運動速度的因素、3。型，瓊脂糖凝膠電泳，聚丙烯酰胺凝膠電泳。在電場的作用下，這些帶電分子將以相反的電荷向電極移動。瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳示意圖。十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳常用于測定蛋白質(zhì)：的分子量。聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺和交聯(lián)劑N，N-亞甲基雙丙烯酰胺在引發(fā)劑和催化劑的作用下聚合交聯(lián)而成的具有三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的凝膠。N，N-亞甲基雙丙烯酰胺(交聯(lián))，丙烯酰胺與交聯(lián)劑N，N-亞甲基雙丙烯酰胺的交聯(lián)共聚。蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的流動性取決于它攜帶的凈電荷和分子的大小。原理：SDS能使蛋白質(zhì)完

5、全變性。它解聚成單個肽鏈，因此測量結(jié)果只是單個肽鏈的分子量。SDS能與多種蛋白質(zhì)形成蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物，其負(fù)電荷大大超過蛋白質(zhì)分子的原始電荷。因此，不同蛋白質(zhì)之間的電荷差異被掩蓋，電泳遷移率完全取決于分子的大小。，3。SDS作用機理：用SDS測定蛋白質(zhì)分子量的方法，在用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質(zhì)分子量時，可以同時選擇一組已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)進(jìn)行電泳，根據(jù)已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的電泳區(qū)帶位置可以確定未知蛋白質(zhì)的分子量。市場上有高分子量、亞高分子量和低分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)試劑。電泳試驗結(jié)果、實驗操作、樣品處理、粗分離、純化和純度鑒定，1。樣品處理：(1)蛋白質(zhì)提取和分離步驟，(2)操作過程

6、，血紅蛋白可以從豬、牛、羊或其他脊椎動物的血液中分離出來。問：血液的成分是什么？問：從雞的紅細(xì)胞中提取脫氧核糖核酸，從豬、牛和羊的紅細(xì)胞中提取血紅蛋白的原因是什么？雞紅細(xì)胞有細(xì)胞核，含有脫氧核糖核酸，便于脫氧核糖核酸的提取；人紅細(xì)胞無細(xì)胞核，結(jié)構(gòu)簡單，血紅蛋白含量豐富，便于提取血紅蛋白。每個肽鏈被一個血紅素基團(tuán)包圍，血紅素基團(tuán)可以攜帶一個分子O2或一個分子CO2。血紅蛋白是紅色的，因為它含有血紅素。血紅蛋白的特點如下：(1)血紅細(xì)胞經(jīng)：洗滌去除雜質(zhì)蛋白，有利于血紅蛋白的后續(xù)分離純化。(1)采集血樣。(2)低速短時間離心(速度越高，時間越長，白色細(xì)細(xì)胞會一起沉淀，不能達(dá)到分離效果)。(3)等離子

7、體抽吸：上層透明黃色等離子體。4.鹽水洗滌：用5倍體積的0.9氯化鈉溶液洗滌下層暗紅色紅細(xì)胞，攪拌10分鐘。5.低速離心一小段時間。6.重復(fù)步驟3、4和5三次。上清液沒有黃色。紅細(xì)胞被清洗干凈。目標(biāo)：操作：洗滌次數(shù)太少，無法去除血漿蛋白。(2)血紅蛋白的釋放：將蒸餾水加入到原始血液體積中，加入40體積的甲苯(溶解細(xì)胞膜)，放入磁力攪拌器中攪拌10分鐘(加速細(xì)胞破裂)，紅細(xì)胞破裂并釋放血紅蛋白，(3)分離血紅蛋白溶液：過程：將攪拌好的混合物轉(zhuǎn)移到離心管中，以2000轉(zhuǎn)/分鐘的速度離心。試管中的溶液層：第1層(頂層):甲苯層(無色透明)；第二層(中層和上層):脂溶性物質(zhì)沉淀層(白色薄層固體)；第三

8、層(中層和下層):血紅蛋白水溶液層(紅色透明液體)；第4層(最底層):雜質(zhì)沉淀層(深紅色)。分離：用濾紙過濾：除去脂溶性沉淀層，置于分液漏斗中：分離下層紅色透明液體。甲苯層(無色透明)、白色薄層固體、紅色透明液體、雜質(zhì)沉淀層(暗紅色)、試管中的溶液層，(4)透析：過程：將1毫升血紅蛋白溶液放入透析袋中，將透析袋放入300毫升20毫升/升磷酸鹽緩沖液(ph 7.0)中，透析12小時。目的：移除它或改變樣品的緩沖液。透析過程的動畫演示，透析用透析袋，2。凝膠色譜操作：(1)凝膠色譜柱的制備：取一根長度為40厘米、內(nèi)徑為1.6厘米的玻璃管，將兩端磨平。底部塞的制作：鉆孔，挖出空腔，安裝移液管頭覆蓋尼

9、龍網(wǎng)，然后用100目尼龍紗包裹，并插入玻璃管的一端。注意：玻璃管的上部不能超過橡皮塞凹孔的底部，否則尼龍網(wǎng)很難鋪好，導(dǎo)致液體殘留和蛋白質(zhì)分離不完全。頂部塞子的制造：沖壓和安裝玻璃管。組裝：根據(jù)相應(yīng)的位置將上述三個部分組裝成一個整體。安裝其他輔助結(jié)構(gòu)。(2)凝膠色譜柱的包裝和凝膠的選擇：a .材料：交聯(lián)葡聚糖凝膠(G-75)。代表意義：“g”表示凝膠的交聯(lián)度、溶脹度和分離范圍。75表示凝膠的產(chǎn)水量，即每克凝膠溶脹時吸收7.5克水。凝膠預(yù)處理：凝膠懸浮液的制備：計算取一定量的凝膠，用蒸餾水或洗脫液浸泡，充分溶脹，制成凝膠懸浮液。2.凝膠b .填充：將凝膠懸浮液一次緩慢倒入色譜柱，填充時輕輕敲打色譜

10、柱，使凝膠填充均勻。注：1。盡可能緊密地填充：減少凝膠顆粒之間的間隙。2.填充凝膠柱時不能有氣泡：氣泡會擾亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫順序，降低分離效果。洗滌天平：連接緩沖洗提瓶，用300毫升20毫升/升磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)在50厘米高的操作壓力下洗滌12小時。注：1。液面不得低于凝膠表面，否則會混入氣泡，影響分離效果。2.洗脫液不應(yīng)變干并暴露凝膠顆粒。(2)填充高度為50厘米的凝膠色譜柱；(3)添加和洗脫樣品，調(diào)節(jié)緩沖液液位：打開下端出口，使緩沖液滴到與凝膠表面齊平，關(guān)閉出口，滴透析樣品：通過吸管吸取1毫升樣品，并將其添加到色譜柱頂部，注意：1。請勿觸摸和損壞凝膠表面。2.將樣品貼在墻上。

11、3.圍繞管壁移動吸管的噴嘴，使樣品滲入凝膠床：打開下出口，使樣品滲入凝膠床。當(dāng)樣品完全進(jìn)入凝膠層后，關(guān)閉下出口進(jìn)行洗脫：加入20摩爾/升的磷酸鹽緩沖液，溶液的酸堿度為7.0，加到合適的高度，連接緩沖液洗脫瓶，打開下出口進(jìn)行洗脫。收集：當(dāng)紅色蛋白質(zhì)接近色譜柱底部時，用試管收集流出液，每5ml收集一個試管，以便連續(xù)收集。(如果紅帶移動均勻，色譜柱制造成功)，(3)樣品添加和洗脫，注意：1。請勿觸摸和損壞凝膠表面。2.將樣品貼在墻上。3.使吸管的噴嘴繞管壁移動。收集純化的蛋白質(zhì)，考慮以下問題：保持血紅蛋白在穩(wěn)定的酸堿度范圍內(nèi)，并保持其結(jié)構(gòu)和功能正常。在血紅蛋白純化的整個過程中，用磷酸鹽緩沖液連續(xù)處理

12、的目的是什么？與其他蛋白質(zhì)相比，血紅蛋白有什么特點？這個特征對你分離血紅蛋白有什么啟示？血紅蛋白是一種有色蛋白質(zhì)，因此可以通過觀察凝膠色譜中的顏色來判斷應(yīng)該何時收集洗脫液。這使得血紅蛋白的分離過程非常直觀，并大大簡化了實驗操作。觀察離心后處理過的血樣是否分層。如果分層不明顯，這可能是洗滌次數(shù)少和未能除去血漿蛋白的原因。此外，如果離心速度太高且時間太長，白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞將一起沉淀，并且不能獲得純紅細(xì)胞，這將影響后續(xù)血紅蛋白提取的純度。實驗結(jié)果的分析和評價，1。你完成血樣的處理了嗎？你能描述一下處理過的樣品發(fā)生了什么變化嗎？2.你填充的凝膠色譜柱有氣泡嗎？你的色譜柱包裝成功了嗎？你怎么判斷？1.由

13、于凝膠是半透明的介質(zhì)，可以在凝膠柱旁邊放置一個垂直于凝膠柱的熒光燈，以檢查凝膠是否填充均勻。2.加入大分子有色物質(zhì)，如藍(lán)色葡聚糖2000或紅色葡聚糖，觀察色帶的移動。如果色帶均勻、窄而平，則凝膠色譜柱性能良好。3.色譜柱中有線條或氣泡。輕敲色譜柱以消除氣泡。如果不能消除氣泡，請重新裝載色譜柱。血紅蛋白的提取和分離過程包括樣品處理、粗分離、純化和純度鑒定。樣品處理：血紅蛋白溶液通過洗滌紅細(xì)胞、釋放血紅蛋白、離心等方法收集。樣品：透析的粗分離去除了分子量較小的雜質(zhì)；樣品純化：凝膠色譜法去除分子量較大的雜質(zhì)；蛋白質(zhì)純度鑒定：聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行純度鑒定。你能描述一下血紅蛋白分離的完整過程嗎？清洗天

14、平：灌裝后，立即用緩沖液洗脫瓶，用300毫升20毫升/升磷酸鹽緩沖液(酸堿度7.0)在50厘米高的操作壓力下清洗12小時。注：1。液面不得低于凝膠表面，否則會混入氣泡，影響柱內(nèi)液體的流動和最終生物大分子物質(zhì)的分離效果。2.不會出現(xiàn)洗脫液流干和凝膠顆粒暴露的現(xiàn)象。(2)填充高度為50厘米的凝膠色譜柱；(3)添加和洗脫樣品并調(diào)節(jié)緩沖液液位：打開下端的出口，使柱中的緩沖液緩慢下降至與凝膠表面齊平，并關(guān)閉出口。滴注透析樣品：用移液管吸取1毫升樣品，并添加到色譜柱頂部。滴加樣品時，移液管的噴嘴靠著管壁移動以添加樣品，同時注意不要損壞凝膠表面。樣品滲入凝膠層：加入樣品后，打開下出口，使樣品滲入凝膠層，待樣

15、品完全進(jìn)入凝膠層后，關(guān)閉下出口。洗脫：小心地將20毫升/升的磷酸鹽緩沖液加到合適的高度，連接緩沖液洗脫瓶，打開下端出口進(jìn)行洗脫。收集：當(dāng)紅色蛋白質(zhì)接近色譜柱底部時，用試管收集流出液，每5ml收集一個試管，以便連續(xù)收集。(在分離過程中，如果紅色區(qū)域移動均勻，則色譜柱制造成功。)注意：正確的采樣操作：1。請勿觸摸和損壞凝膠表面。2.將樣品貼在墻上。3.使吸管的噴嘴繞管壁移動。(3)樣品添加和洗脫。注：加樣的正確操作如下：1 .請勿觸摸和損壞凝膠表面。2.將樣品貼在墻上。3.使吸管的噴嘴繞管壁移動。觀察您處理的血樣在離心后是否分層(見教科書中的圖5-18)。如果分層不明顯，這可能是洗滌次數(shù)少和未能除去血漿蛋白的原因。此外，如果離心速度太高且時間太長，白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞將一起沉淀，并且不能獲得純紅細(xì)胞，這將影響后