紫外-可見(jiàn)分光光度法2

1、10.3紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，10.3.1紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)的主要部件，以及紫外-可見(jiàn)儀器的光路圖，用于提供足夠的強(qiáng)度和穩(wěn)定的連續(xù)光譜。分光光度計(jì)常用的光源有兩種：熱輻射光源和氣體放電光源?？梢?jiàn)光區(qū)：鎢燈和鹵鎢燈(350納米)，紫外光區(qū)：氫燈和氘燈(150-400納米)，1。光源，2。單色儀、色散元件主要是棱鏡、光柵和濾光器。棱鏡色散的原理是根據(jù)光通過(guò)棱鏡時(shí)的不同折射率來(lái)分離不同波長(zhǎng)的光。棱鏡的光學(xué)特性可以用色散率和分辨率來(lái)表征；棱鏡的頂角或折射率越大，作用色散越大，分離兩條相鄰譜線(xiàn)的能力越強(qiáng)。色散率a。作用色散率：用d/d表示，即偏轉(zhuǎn)角對(duì)波長(zhǎng)的變化率；線(xiàn)色散率：用dl /d表示，焦平面上兩

2、條相鄰譜線(xiàn)之間的距離相對(duì)于波長(zhǎng)的變化率；c .反向離差率：以d/dl表示。分辨率：兩個(gè)相鄰譜線(xiàn)之間分離程度的量度：兩個(gè)相鄰譜線(xiàn)的平均波長(zhǎng)；兩條譜線(xiàn)之間的波長(zhǎng)差；b:棱鏡的底邊長(zhǎng)度；n:棱鏡介電材料的折射率。分辨率與波長(zhǎng)有關(guān)，長(zhǎng)波的分辨率小于短波，棱鏡分離的光譜屬于非均勻光譜。例如，30000納米附近的分光計(jì)的分辨率是50000。它表明兩條譜線(xiàn)之間的波長(zhǎng)差必須大于或等于0.6納米，以便清楚地區(qū)分。光柵、透射光柵、反射光柵；光柵光譜的產(chǎn)生是光在每個(gè)凹槽上衍射或散射，然后在某個(gè)方向上發(fā)生干涉后的不同級(jí)別的衍射光譜。它可用于紫外、可見(jiàn)和紅外區(qū)域，并在整個(gè)波長(zhǎng)范圍內(nèi)具有良好且?guī)缀蹙鶆虻姆直媛?。通過(guò)將反射

3、光柵的狹縫加工成合適的形狀，可以將有效強(qiáng)度集中在特定的衍射角上。圖中所示的反射光柵由與光柵表面成一角度的小斜面(閃耀光柵)組成，該角度稱(chēng)為閃耀角。通過(guò)選擇合適的閃耀角，90%的有效能量可以集中在單級(jí)衍射上。光柵的分辨率R等于光譜階數(shù)(N)與光柵凹口數(shù)量(N)的乘積：光柵越寬，單位凹口數(shù)量越多，R越大，寬度50毫米，N=1200/毫米，一階光譜分辨率：R=1501200=6104，狹縫太寬，單色光不純，導(dǎo)致偏離朗伯定律。窄縫降低了光通量和靈敏度。狹縫兩邊的邊緣應(yīng)該是尖銳的，并且在同一平面上。準(zhǔn)直器將進(jìn)入入射狹縫的發(fā)散光轉(zhuǎn)換成平行光，并在出射狹縫收集分散的平行單色光?？梢?jiàn)光區(qū)：玻璃或應(yīng)時(shí)池紫外光區(qū)

4、：應(yīng)時(shí)池包含空白和樣品吸收池，其厚度和透光率應(yīng)相同。校準(zhǔn)吸收池：a池填充空白，b池填充樣品，a池測(cè)量；相反，池b充滿(mǎn)空白，池a充滿(mǎn)樣品，池a被測(cè)量。兩次測(cè)量的差值應(yīng)小于1%。3。吸收池、光電轉(zhuǎn)換器、光電池、光電倍增器、光電二極管陣列探測(cè)器。探測(cè)器、光電池：特點(diǎn)：光電池內(nèi)阻小，電流不易放大，直接用微電流計(jì)測(cè)量，適用于單色光譜帶寬S大的低檔儀器；容易“疲勞”。硒光電池、硅光電池、光電池、光電倍增管、光電倍增管)、光電二極管陣列探測(cè)器：結(jié)構(gòu)和原理：一系列光電二極管探測(cè)器緊密排列在晶體硅上。當(dāng)光通過(guò)晶體硅時(shí)，二極管輸出的電信號(hào)與光強(qiáng)成正比。二極管數(shù)量越多，分辨率越高。它可以快速收集光譜。例如，HP84

5、52A二極管陣列由316個(gè)190納米和820納米范圍內(nèi)的二極管組成。每個(gè)二極管可以在1/10秒內(nèi)每2納米測(cè)量一次，同時(shí)可以并行測(cè)量316個(gè)數(shù)據(jù)，在1/10秒內(nèi)可以獲得完整的光譜特點(diǎn)：結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，但要求光源發(fā)光強(qiáng)度穩(wěn)定。2。雙光束分光光度計(jì)。帶有多通道二極管陣列檢測(cè)的分光光度計(jì)。光源發(fā)出的光經(jīng)色差聚光器聚焦后穿過(guò)樣品池，然后聚焦在多色儀的入射狹縫上。透射光被全息光柵表面散射并投射到二極管陣列檢測(cè)器。中檔儀器的光學(xué)性能，1。波長(zhǎng)范圍：195820納米，2。波長(zhǎng)準(zhǔn)確度：儀器顯示的波長(zhǎng)與單色光的實(shí)際波長(zhǎng)之間的誤差為0.5納米，3。波長(zhǎng)再現(xiàn)性：0.5納米，4。透射比測(cè)量范圍：0150%，5。吸光度測(cè)量范圍

6、：0.17302.00，6。260納米處的發(fā)光度為0.3納米，9。雜散光220納米鋁(1%克/毫升)包含5%的雜散光強(qiáng)度。短波長(zhǎng)校準(zhǔn)：苯蒸氣吸收光譜或苯乙醇光譜中的波長(zhǎng)校準(zhǔn)：氫燈或氘燈的發(fā)射線(xiàn)一般采用486.13nm(f線(xiàn))和656.28nm(c線(xiàn))的長(zhǎng)波長(zhǎng)校準(zhǔn)：鐠釹玻璃的吸收光譜，10月3日儀器校準(zhǔn)，波長(zhǎng)校準(zhǔn)，苯蒸氣在紫外區(qū)有特征吸收峰，苯蒸氣一般用于波長(zhǎng)校準(zhǔn)。 在吸收池中滴一滴液態(tài)苯，蓋上吸收池，用苯蒸汽填充吸收池，測(cè)量其吸收光譜，并使用測(cè)量的吸收光譜校正波長(zhǎng)。 鐠釹玻璃濾光片的吸收光譜，K2CrO4標(biāo)準(zhǔn)溶液常用于校正吸收度標(biāo)度。吸光度測(cè)量中使用的吸收池應(yīng)配對(duì)(樣品池和參比池)，否則應(yīng)進(jìn)行

7、校準(zhǔn)。吸光度校正，表：鉻酸鉀溶液的吸光度。使用一段時(shí)間后，磨損和污染會(huì)導(dǎo)致透光性能的差異。如有必要，請(qǐng)檢查并糾正。要求同一儀器上同一濃度溶液的兩次測(cè)量誤差應(yīng)小于1%，吸收池校準(zhǔn)，10.4紫外-可見(jiàn)分光光度法，定性分析，定性鑒定，純度檢查和雜質(zhì)限量測(cè)定，單組分定量分析，多組分定量分析，10.4.1定性鑒定，基于：大多數(shù)有機(jī)化合物具有紫外吸收光譜特性。1。特征值：2。在相同的條件下，具有相同吸收光譜形狀的化合物應(yīng)該具有相同的吸收光譜(即吸收曲線(xiàn))。定性鑒別方法：比較法，a .比較吸收光譜特征數(shù)據(jù)是否一致，b .比較吸光度比值或吸收系數(shù)比值，例如：維生素B12定性鑒別，c .比較吸收光譜一致性，在相

8、同條件下，進(jìn)行：樣品光譜曲線(xiàn)和對(duì)照紫外光譜定性鑒別有其局限性，因?yàn)楣庾V只有一個(gè)或幾個(gè)寬吸收帶，其特征不強(qiáng)，其形狀變化不大。特別地，在相同的條件下，具有相同吸收光譜的物質(zhì)可以是相同的物質(zhì)。如果在相同條件下吸收光譜不同，那么它們肯定不是同一種物質(zhì)。圖三種類(lèi)固醇激素(10g/ml甲醇)、醋酸氫化可的松、醋酸潑尼松、醋酸可的松的紫外吸收光譜，10.4.2純度檢查，1。雜質(zhì)檢查，選擇一個(gè)，被測(cè)物質(zhì)有吸收，雜質(zhì)無(wú)吸收，被測(cè)物質(zhì)有弱吸收，雜質(zhì)有強(qiáng)吸收；2.雜質(zhì)限量檢查，藥物無(wú)吸收，且雜質(zhì)最高。例：腎上腺素中微量雜質(zhì)腎上腺素含量的計(jì)算，2mg/mL -0.05mol/L鹽酸溶液，310nm處測(cè)定A3100.0

9、5，即0.06%的合格雜質(zhì)限度，10.4.3單組分定量法，溶劑選擇，測(cè)定波長(zhǎng)選擇，高靈敏度、小干擾就地測(cè)定，吸光系數(shù)法標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法定量法：1。吸光度系數(shù)法(絕對(duì)法)，求百分比：或以下方法：視在值，例：準(zhǔn)確稱(chēng)取25.0毫克B12樣品，用水溶液制成100毫升。準(zhǔn)確吸取10.00毫升，放入100毫升容量瓶中，加水至刻度。將該溶液置于1cm的吸收池中，在361nm處測(cè)量吸光度為0.507，并計(jì)算B12的百分含量？解決方案：或解決方案：2。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法，蘆丁含量測(cè)定，0.710毫克/25毫升，3。標(biāo)準(zhǔn)控制方法，注：當(dāng)樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)溶液的稀釋比例相同時(shí)，如維生素B12含量測(cè)定，準(zhǔn)確吸收2.50毫升B12注射液

10、，稀釋至10.00毫升；用水；此外，制備對(duì)照溶液，準(zhǔn)確稱(chēng)量25.00毫克對(duì)照品，用水稀釋至1000毫升。在361納米處，用1cm吸收池分別測(cè)量0.508和0.518的吸光度，計(jì)算B12注射液的濃度和標(biāo)記量的百分比(B12注射液的標(biāo)記量為100克/毫升)，求解：對(duì)照法，10.4.4多組分定量法計(jì)算分光光度法，可分為：有三種情況：1。兩種組分的吸收光譜不重疊(不相互干擾)。兩個(gè)分量在其各自的最大值下不重疊，并分別由單個(gè)分量量化。2.兩種成分的吸收光譜部分重疊。1.A1b成分的測(cè)量不會(huì)產(chǎn)生干擾。2.A2a成分干擾的測(cè)量不能用ca的單成分定量測(cè)量來(lái)測(cè)量。3.兩組分吸收光譜完全重疊的混合樣品的測(cè)量。(1

11、)線(xiàn)性方程組的求解(2)等吸收雙波長(zhǎng)消除法(3)系數(shù)乘法(4)其他方法，(1)線(xiàn)性方程組的求解步驟：(2)等吸收雙波長(zhǎng)消除法，步驟：消除甲對(duì)乙的影響，消除乙對(duì)甲的影響，雙波長(zhǎng)法必須滿(mǎn)足兩個(gè)基本條件：甲。所選兩個(gè)波長(zhǎng)下的干涉分量具有相等性(3)系數(shù)乘法，前提：干涉分量乙不是峰形且沒(méi)有相等的吸收點(diǎn)。在繼續(xù)之前，步驟：在B曲線(xiàn)上找到一個(gè)點(diǎn)1和另一個(gè)點(diǎn)2。優(yōu)點(diǎn)：同時(shí)，待測(cè)分量和兩點(diǎn)干擾分量的信號(hào)放大了k倍，從而增加了A值，提高了靈敏度。然而，k值被限制為57，否則信噪比將由于噪聲放大而降低，這不利于測(cè)量。(4)導(dǎo)數(shù)光譜，A=CLE=CLf()，寫(xiě)出吸收光譜作為波長(zhǎng)的函數(shù)：函數(shù)圖：0階光譜，函數(shù)圖：函數(shù)圖：一階導(dǎo)數(shù)光譜，二階導(dǎo)數(shù)光譜，N階導(dǎo)數(shù)光譜，導(dǎo)數(shù)光譜練習(xí)：手工計(jì)算和繪制：每隔一段時(shí)間，奇異階的峰導(dǎo)數(shù)圖就是0值偶數(shù)階導(dǎo)數(shù)圖的極值(有利于峰的識(shí)別)， 奇異階導(dǎo)數(shù)圖中的拐點(diǎn)是極值偶數(shù)階導(dǎo)數(shù)圖0-值(識(shí)別肩峰)，導(dǎo)數(shù)階增加，極值數(shù)增加=導(dǎo)數(shù)階1(提高分辨率，識(shí)別重疊光譜帶)，導(dǎo)數(shù)光譜的定量原理：同樣可以得到：通過(guò)導(dǎo)數(shù)光譜消除干擾吸收，如果：干擾吸收可以表示為冪函數(shù)。 n-1階導(dǎo)數(shù)圖中n-階函數(shù)的消去也就是說(shuō)，隨著導(dǎo)數(shù)階的增加，干擾背景將逐漸減弱甚至消失。導(dǎo)數(shù)光譜法對(duì)定量數(shù)據(jù)的測(cè)量