7DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄翻譯(2).ppt

1、主講教師：黃慧聰,醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)基礎(chǔ),肺炎支原體肺炎流行病學(xué)、臨床特征與診療規(guī)范化研究潘長(zhǎng)旺,發(fā)展簡(jiǎn)史,2,主要內(nèi)容,3,4,5,DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯,DNA重組與基因工程,基因與疾病,1,發(fā)展簡(jiǎn)史,準(zhǔn)備和醞釀,建立和發(fā)展,蛋白質(zhì)是生命的主要基礎(chǔ)物質(zhì),DNA是遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ),遺傳中心法則的建立,蛋白質(zhì)翻譯合成的基本過(guò)程,1953年 Watson-Crick的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型,Watson-Crick的DNA雙螺旋,主要內(nèi)容,基因工程技術(shù),基因表達(dá)的調(diào)控,生物大分子的結(jié)構(gòu)和功能,生物信息學(xué),DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯,中心法則（ central dogma）,遺傳信息傳遞方向的規(guī)律,DNA通過(guò)

2、復(fù)制將遺傳信息由親代傳遞給子代；通過(guò)轉(zhuǎn)錄和翻譯，將遺傳信息傳遞給蛋白質(zhì)分子，從而決定生物的表現(xiàn)型。DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程就構(gòu)成了遺傳學(xué)的中心法則。,在RNA病毒中，其遺傳信息貯存在RNA分子中。遺傳信息的流向是RNA通過(guò)復(fù)制，將遺傳信息由親代傳遞給子代，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄將遺傳信息傳遞給DNA，再由DNA通過(guò)轉(zhuǎn)錄和翻譯傳遞給蛋白質(zhì)，這種遺傳信息的流向就稱(chēng)為反中心法則。,染色體結(jié)構(gòu)與DNA復(fù)制 基因的轉(zhuǎn)錄與加工 蛋白質(zhì)的翻譯 蛋白質(zhì)合成后的修飾加工 蛋白質(zhì)合成后的靶向輸送,一、染色體結(jié)構(gòu)與DNA復(fù)制,（一）復(fù)制的基本規(guī)律 （二）DNA復(fù)制的條件 （三）DNA生物合成過(guò)程 （四）真核生物端粒 （五）

3、逆轉(zhuǎn)錄,染色體：,DNA,基因,基因和染色體，DNA和脫氧核苷酸的關(guān)系：,每一條染色體只含有一個(gè)DNA分子，每個(gè)DNA分子上有很多基因，基因是DNA片段，在染色體上呈線(xiàn)性排列，每個(gè)基因中又有成百上千個(gè)脫氧核苷酸。每個(gè)基因有特定的脫氧核苷酸排列順序，它代表著遺傳信息,是基因的載體。,DNA在復(fù)制時(shí)，以親代DNA的每一股作模板，合成完全相同的兩個(gè)雙鏈子代DNA，每個(gè)子代DNA中都含有一股親代DNA鏈，這種現(xiàn)象稱(chēng)為DNA的半保留復(fù)制(semi-conservative replication)。,1、半保留復(fù)制,（一）復(fù)制的基本規(guī)律,DNA半保留復(fù)制示意圖,DNA半保留復(fù)制研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖,按半保

4、留復(fù)制方式，子代DNA與親代DNA的堿基序列一致，即子代保留了親代的全部遺傳信息，體現(xiàn)了遺傳的保守性。 遺傳的保守性，是物種穩(wěn)定性的分子基礎(chǔ)，但不是絕對(duì)的。,半保留復(fù)制的意義,DNA在復(fù)制時(shí)，需在特定的位點(diǎn)起始，這是一些具有特定核苷酸排列順序的片段，即復(fù)制起始點(diǎn)(origin) 。 在原核生物中，復(fù)制起始點(diǎn)通常為一個(gè)，而在真核生物中則為多個(gè)。,2、有一定的復(fù)制起始點(diǎn),復(fù)制起始點(diǎn)與復(fù)制子示意圖,習(xí)慣上把兩個(gè)相鄰DNA復(fù)制起始點(diǎn)之間的距離（或DNA片段）定為一個(gè)復(fù)制子(replicon) 。 復(fù)制子是獨(dú)立完成復(fù)制的功能單位。 DNA復(fù)制時(shí)，局部雙螺旋解開(kāi)形成兩條單鏈，這種叉狀結(jié)構(gòu)稱(chēng)為復(fù)制叉。,復(fù)制

5、起始點(diǎn)、復(fù)制子與復(fù)制叉（動(dòng)畫(huà)演示）,參與DNA復(fù)制的DNA聚合酶，必須以一段具有3端自由羥基（3-OH）的RNA作為引物(primer) ，才能開(kāi)始聚合子代DNA鏈。 RNA引物的大小，在原核生物中通常為50 100個(gè)核苷酸，而在真核生物中約為10個(gè)核苷酸。RNA引物的堿基順序，與其模板DNA的堿基順序相配對(duì)。,3、需要引物,DNA復(fù)制時(shí)，以復(fù)制起始點(diǎn)(origin)為中心，向兩個(gè)方向進(jìn)行解鏈，形成兩個(gè)延伸方向相反的復(fù)制叉，稱(chēng)為雙向復(fù)制(bidirectional replication)。 但在低等生物中，也可進(jìn)行單向復(fù)制（如滾環(huán)復(fù)制）。,4、雙向復(fù)制,DNA聚合酶只能以53方向聚合子代DN

6、A鏈，即模板DNA鏈的方向必須是35。 由于DNA分子中兩條鏈的走向相反，因此當(dāng)分別以?xún)蓷l親代DNA鏈作為模板聚合子代DNA鏈時(shí)，子代鏈的聚合方向也是不同的。,5、半不連續(xù)復(fù)制,領(lǐng)頭鏈 (leading strand),隨從鏈 (lagging strand),DNA的半不連續(xù)復(fù)制,以35方向的親代DNA鏈作模板的子代鏈在復(fù)制時(shí)基本上是連續(xù)進(jìn)行的，其子代鏈的聚合方向?yàn)?3，這一條鏈被稱(chēng)為領(lǐng)頭鏈(leading strand)。 以53方向的親代DNA鏈為模板的子代鏈在復(fù)制時(shí)則是不連續(xù)的，其鏈的聚合方向也是53，這條鏈被稱(chēng)為隨從鏈(lagging strand)。 領(lǐng)頭鏈連續(xù)復(fù)制而隨從鏈不連續(xù)復(fù)

7、制，就是復(fù)制的半不連續(xù)性。,由于親代DNA雙鏈在復(fù)制時(shí)是逐步解開(kāi)的，因此，隨從鏈的合成也是一段一段的。DNA在復(fù)制時(shí)，由隨從鏈所形成的一些子代DNA短鏈稱(chēng)為岡崎片段(Okazaki fragment)。 岡崎片段的大小，在原核生物中約為10002000個(gè)核苷酸，而在真核生物中約為100個(gè)核苷酸。,以四種脫氧核糖核酸(deoxynucleotide triphosphate)為底物，即dATP，dGTP，dCTP，dTTP。,1、底物(substrate),（二）DNA復(fù)制的條件,DNA復(fù)制過(guò)程中脫氧核糖核苷酸的聚合反應(yīng),DNA復(fù)制是模板依賴(lài)性的，必須要以親代DNA鏈作為模板。親代DNA的兩股鏈

8、解開(kāi)后，可分別作為模板進(jìn)行復(fù)制。,2、模板(template),引物酶(primerase)本質(zhì)上是一種依賴(lài)DNA的RNA聚合酶（DDRP），該酶以DNA為模板，聚合一段RNA短鏈引物(primer)，以提供自由的3-OH，使子代DNA鏈能夠開(kāi)始聚合。 引物酶需組裝成引發(fā)體才能催化RNA引物的合成。,3、引發(fā)體和RNA引物,引物酶催化合成短鏈RNA引物分子,引物,引物酶,4、DNA聚合酶,全稱(chēng)：依賴(lài)DNA的DNA聚合酶 ( DNA-dependent DNA polymerase, DDDP ) 簡(jiǎn)稱(chēng)：DNA-pol 活性：1. 53 的聚合酶活性 2. 核酸外切酶活性,DNA連接酶(DNA

9、ligase)可催化兩段DNA片段之間磷酸二酯鍵的形成，從而把兩段相鄰的DNA鏈連接成一條完整的鏈。,5、DNA連接酶,DNA連接酶的連接作用,DNA復(fù)制過(guò)程簡(jiǎn)圖,DNA連接酶在復(fù)制中起最后接合缺口的作用。 在DNA修復(fù)、重組及剪接中也起縫合缺口作用。 是基因工程的重要工具酶之一。,DNA連接酶的作用,解螺旋酶(helicase) ，又稱(chēng)解鏈酶或rep蛋白，是用于解開(kāi)DNA雙鏈的酶蛋白。 每解開(kāi)一對(duì)堿基，需消耗2分子ATP。,6、解螺旋酶,單鏈DNA結(jié)合蛋白（single strand binding protein, SSB），又稱(chēng)螺旋反穩(wěn)蛋白(HDP)，是一些能夠與單鏈DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)因

10、子。,7、單鏈DNA結(jié)合蛋白,SSB的生理作用,使解開(kāi)雙螺旋后的DNA單鏈能夠穩(wěn)定存在，即穩(wěn)定單鏈DNA，便于其作為模板復(fù)制子代DNA； 保護(hù)單鏈DNA，避免核酸酶的降解。,8、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶,人類(lèi)拓?fù)洚悩?gòu)酶的分子結(jié)構(gòu),能夠松解DNA超螺旋結(jié)構(gòu)的酶。,DNA復(fù)制過(guò)程中正超螺旋的形成,解鏈過(guò)程中正超螺旋的形成,拓?fù)洚悩?gòu)酶的作用特點(diǎn) 既能水解 、又能連接磷酸二酯鍵,拓?fù)洚悩?gòu)酶 拓?fù)洚悩?gòu)酶,分 類(lèi),DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶的作用機(jī)制,1、復(fù)制的起始,（三） DNA生物合成過(guò)程,解旋解鏈，形成復(fù)制叉 引發(fā)體組裝和引物合成,2、復(fù)制的延長(zhǎng),DNA聚合酶,dATP,dGTP,dTTP,dCTP,dTTP,dGT

11、P,dATP,dCTP,OH 3,3,DNA復(fù)制的延長(zhǎng)過(guò)程,3、復(fù)制的終止,去除引物，填補(bǔ)缺口 連接岡崎片段,端粒（telomere）是指真核生物染色體線(xiàn)性DNA分子末端的結(jié)構(gòu)部分，通常膨大成粒狀。,（四）真核生物端粒,線(xiàn)性DNA在復(fù)制完成后，其末端由于引物RNA的水解而可能出現(xiàn)縮短。故需要在端粒酶（telomerase）的催化下，進(jìn)行延長(zhǎng)反應(yīng)。,端粒酶(telomerase),端粒酶是一種RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體，它可以其RNA為模板，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程對(duì)末端DNA鏈進(jìn)行延長(zhǎng)。,端粒酶的分子結(jié)構(gòu),端粒酶的爬行模型（動(dòng)畫(huà)演示）,（五） 逆轉(zhuǎn)錄,1、逆轉(zhuǎn)錄病毒和逆轉(zhuǎn)錄酶,逆轉(zhuǎn)錄病毒細(xì)胞內(nèi)的逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象：,

12、2、逆轉(zhuǎn)錄研究的意義,逆轉(zhuǎn)錄酶和逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象，是分子生物學(xué)研究中的重大發(fā)現(xiàn)。 逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象說(shuō)明：至少在某些生物，RNA同樣兼有遺傳信息傳代與表達(dá)功能。 對(duì)逆轉(zhuǎn)錄病毒的研究，拓寬了20世紀(jì)初已注意到的病毒致癌理論。,（一）RNA的轉(zhuǎn)錄過(guò)程：（略） 轉(zhuǎn)錄起始 鏈的延伸 轉(zhuǎn)錄終止,二、基因的轉(zhuǎn)錄與加工,（二）RNA的轉(zhuǎn)錄后加工 在細(xì)胞內(nèi)，由RNA聚合酶合成的原初轉(zhuǎn)錄物（primary transcript）往往需要一系列的變化，才轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓腞NA分子。此過(guò)程總稱(chēng)為RNA的成熟或稱(chēng)為RNA的轉(zhuǎn)錄后加工。,1、mRNA前體的加工： 原核生物的mRNA轉(zhuǎn)錄后一般不需要加工，轉(zhuǎn)錄的同時(shí)即進(jìn)行翻譯（半壽期短）。

13、亦有少數(shù)多順?lè)醋拥膍RNA需要核酸酶切成小單位，然后再翻譯。,真核生物mRNA（半壽期較長(zhǎng)）轉(zhuǎn)錄物很大，在加工過(guò)程中形成許多分子大小不等的中間物，它們被稱(chēng)為核內(nèi)不均一RNA（heterogeneous nuclear RNA, hnRNA)，需要進(jìn)一步進(jìn)行加工修飾轉(zhuǎn)化為mRNA。加工包括： （1）hnRNA被剪接，把內(nèi)含子（DNA上非編碼序列）轉(zhuǎn)錄序列剪掉，把外顯子（DNA上的編碼序列）轉(zhuǎn)錄序列拼接上(真核生物一般為不連續(xù)基因)。 （2）3端添加polyA “尾巴”； （3）5端連接“帽子”結(jié)構(gòu)（m7G5ppp5NmpNp-）； （4）分子內(nèi)部的核苷酸甲基化修飾。,2、tRNA前體的加工： 原

14、核與真核生物的tRNA轉(zhuǎn)錄后都需要加工。,3、 rRNA前體的加工：,原核與真核生物的rRNA轉(zhuǎn)錄后也都需要進(jìn)行加工。 原核：剛轉(zhuǎn)錄的rRNA為30S，先在特定的堿基上進(jìn)行甲基化（核糖2-羥基）修飾，后逐步裂解。 真核：45S（哺乳動(dòng)物）、38S（果蠅）、37S（酵母）,tRNAs are cleaved from transcripts of rRNA operons,三、蛋白質(zhì)的翻譯,1、遺傳密碼 (genetic code): DNA（或mRNA）中核苷酸序列與蛋白質(zhì)中氨基酸序列之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系。 2、密碼子(codon)： mRNA上每3個(gè)相鄰核苷酸編碼多肽鏈中一個(gè)氨基酸，這三個(gè)核苷酸稱(chēng)

15、一個(gè)密碼子或三聯(lián)體密碼。,（一）遺傳密碼兩個(gè)概念,3、 遺傳密碼字典,mRNA：蛋白質(zhì)的DNA序列信息的中間體。 tRNA：運(yùn)送特定氨基酸到核糖體上合成蛋白質(zhì)。 rRNA：核糖體的組成元件。,（二）蛋白質(zhì)合成中使用的RNA,1、mRNA 是蛋白質(zhì)合成的模板,原核生物mRNA與真核生物mRNA結(jié)構(gòu)比較,核糖體可以不從mRNA上解離連續(xù)合成三個(gè)蛋白質(zhì),2、 tRNA轉(zhuǎn)運(yùn)活化的氨基酸至mRNA模板上,有20種分子轉(zhuǎn)換器，每種氨基酸一個(gè),3、 rRNA核糖體是蛋白質(zhì)合成的工廠(chǎng),核糖體得到分離后，發(fā)現(xiàn)含有RNA，即稱(chēng)rRNA。,（三）核糖體大小亞基的生物學(xué)功能,小亞基： 通過(guò)密碼子與反密碼子的配對(duì)，識(shí)別

16、并結(jié)合模板mRNA，蛋白質(zhì)合成中A位、P位、E位的一部分等。 大亞基： 結(jié)合多肽鏈，催化肽鍵形成、蛋白質(zhì)合成中A位、P位、E位的一部分等。, mRNA結(jié)合部位； 結(jié)合AA-tRNA部位（A位）； 結(jié)合肽基 tRNA部位（P位）； 空載tRNA移出部位（E位）； 形成肽鍵的部位。 此外，還有用于起始和延伸的各種蛋白質(zhì)因子結(jié)合部位。,核糖體發(fā)揮生物學(xué)功能的5個(gè)基本部位,Ala（A） Val（V） Leu（L） Ile（I） Pro（P） Met（M） His（H） Gly（G） Ser（S） Thr（T） Cys （C） Phe（F） Trp（W） Asp（D） Glu（E） Lys（K） Gln（Q） Arg（R） Tyr（Y） Asn（N）,（四） 蛋白質(zhì)合成中使用的20種氨基酸,1、蛋白質(zhì)合成的起始,多數(shù)多順?lè)醋拥姆g獨(dú)立發(fā)生某些細(xì)菌中，mRNA相鄰順?lè)醋臃g直接相連，可由一個(gè)核糖體翻譯,（五） 蛋白質(zhì)合成的生物學(xué)