細胞培養(yǎng)-正常組織細胞的培養(yǎng)

1、正常組織細胞的培養(yǎng),病原學教研室 申艷娜,2,主要內(nèi)容,培養(yǎng)細胞的取材 組織材料的分離 原代細胞培養(yǎng) 幾種細胞培養(yǎng)方法舉例 建立細胞系,3,主要內(nèi)容,培養(yǎng)細胞的取材 組織材料的分離 原代細胞培養(yǎng) 幾種細胞培養(yǎng)方法舉例 建立細胞系,4,培養(yǎng)細胞的取材,取材的基本要求 新鮮標本 嚴格無菌操作 盡可能減少對細胞的機械損傷 盡量去除血液、剔除脂肪、結(jié)締組織等 同時保留組織學標本（光鏡和電鏡）,培養(yǎng)細胞的取材,基本器材和用品 手術(shù)器械 青霉素小瓶（含培基或緩沖液） 小燒杯 培養(yǎng)皿,6,培養(yǎng)細胞的取材,皮膚和粘膜的取材 內(nèi)臟和實體瘤的取材 血細胞取材 骨髓、羊水、胸腹水內(nèi)細胞的取材 其他組織的取材,培養(yǎng)細

2、胞的取材,皮膚和粘膜的取材 上皮細胞的來源 方法似外科斷層皮片手術(shù) 面積一般2-3mm2，取材盡量薄 可用高濃度抗生素漂洗,人類角質(zhì)形成細胞,8,培養(yǎng)細胞的取材,內(nèi)臟和實體瘤的取材 常用的細胞培養(yǎng)材料 內(nèi)臟除腸道外多無菌 實體瘤因破潰、感染可能伴有細菌,9,培養(yǎng)細胞的取材,血細胞取材 染色體分析 淋巴細胞體外激活，進行免疫治療,骨髓、羊水、胸腹水內(nèi)細胞的取材 無需特別處理，離心后直接接種,10,主要內(nèi)容,培養(yǎng)細胞的取材 組織材料的分離 原代細胞培養(yǎng) 幾種細胞培養(yǎng)方法舉例 建立細胞系,組織材料的分離,機械法 化學法,組織材料的分離,細胞懸液的分離 低速離心 500-1000rpm 10 min,

3、13,組織材料的分離,組織塊的分離 機械分散法 機械分散法 注射器針芯擠壓 不銹鋼濾網(wǎng) 剪切分離法,14,組織材料的分離,組織塊的分離 機 械 分 散 法,15,組織材料的分離,組織塊的分離 消化分離法 胰蛋白酶 適合胚胎、上皮、肝、腎等組織消化。 pH、溫度、酶蛋白濃度、組織塊大小影響消化效果。 濃度為0.10.5，pH 8.0. 與EDTA混合使用。,16,組織材料的分離,組織塊的分離 消化分離法 膠原酶 分為、四種類型。 根據(jù)分離組織類型選擇相應(yīng)型的膠原酶。 對膠原有較強的消化作用，適合消化纖維性組織、上皮和癌組織。 濃度為0.030.3。,17,主要內(nèi)容,培養(yǎng)細胞的取材 組織材料的分離

4、 原代細胞培養(yǎng) 幾種細胞培養(yǎng)方法舉例 建立細胞系,18,原代細胞培養(yǎng),原代培養(yǎng) 定義：是從供體取得組織細胞后在體外進行的首次培養(yǎng)。 優(yōu)點：生物特性未發(fā)生很大變化，最接近和反映體內(nèi)生長特性。,原代細胞培養(yǎng),培養(yǎng)方法 組織塊法 消化法,20,原代細胞培養(yǎng),可能遇到的問題 完全無細胞游出或移動； 有細胞移動和游出，但無細胞增殖，細胞長時間處于停滯狀態(tài)以致難以傳代； 有細胞增殖，傳若干代后停止生長或衰退死亡；,21,原代細胞培養(yǎng),可能遇到的問題 傳數(shù)代后細胞增殖緩慢，經(jīng)過一段停滯期后，才又呈旺盛生長狀態(tài)，形成穩(wěn)定生長的腫瘤傳代細胞系。,22,原代細胞培養(yǎng),問題的解決方法 加入適宜底物 把經(jīng)過純化的細胞

5、接種在不同的底物上，如鼠尾膠原底層、飼細胞層等。,23,原代細胞培養(yǎng),問題的解決方法 加入生長因子 應(yīng)用促細胞生長因子，向培養(yǎng)液中增加一種或幾種促細胞生長因子。根據(jù)細胞種類不同選用不同的促生長物，常用有胰島素、氫化可的松、雌激素以及其它生長因子。,24,主要內(nèi)容,培養(yǎng)細胞的取材 組織材料的分離 原代細胞培養(yǎng) 幾種細胞培養(yǎng)方法舉例 建立細胞系,表皮細胞 在人和動物體內(nèi)，表皮細胞生長在膠原基質(zhì)膜上，并從基質(zhì)膜獲取生長分化所需要的物質(zhì)，因此體外培養(yǎng)培養(yǎng)需要使用某些基質(zhì)、培養(yǎng)液及包括滋養(yǎng)層在內(nèi)的一些添加物。,幾種細胞培養(yǎng)方法舉例,無菌切取皮膚標本，用DBSS沖洗35遍。 將標本的上皮層面朝下放入干燥的

6、培養(yǎng)皿中，加數(shù)滴PBS使之濕潤，用彎剪盡可能除凈皮下脂肪和結(jié)締組織，將標本切成大約1cmX2cm的小塊。 用無Ca2+、Mg2+的PBS 沖洗標本至少3次，將標本放入胰蛋白酶溶液中或中性分散酶II中，4放置15-48h，或37 1-3h。,幾種細胞培養(yǎng)方法舉例,幾種細胞培養(yǎng)方法舉例,表皮層和真皮層分離時,表皮層為棕色，真皮層為白色，觀察到表皮與真皮分離時將其一如到另一10cm塑料平皿，真皮向下，用5ml血清完全培養(yǎng)液沖洗，用彎鑷輕輕將表皮剝脫，放入含20ml培養(yǎng)液的50ml離心管中，反復(fù)吹打，過100目尼龍篩，使角化上皮細胞分離。,滋養(yǎng)層細胞制備 在已形成單層的3T3細胞培養(yǎng)瓶中加入絲裂霉素，

7、使3T3細胞不在分裂增殖，即可作為表皮細胞的黏附滋養(yǎng)細胞。 黏壁劑包被 用0.01%的膠原蛋白鋪于培養(yǎng)瓶的底部，過夜，棄上清，40烘干，制成膠原蛋白黏附膜，紫外線照射2h消毒備用。,幾種細胞培養(yǎng)方法舉例,29,幾種細胞培養(yǎng)方法舉例,臍靜脈血管內(nèi)皮細胞 取健康產(chǎn)婦分娩正常新生兒后6小時以內(nèi)的臍帶，立即浸泡在含青霉素、鏈霉素的D-Hanks液中，洗去外部血污。在超靜工作臺上剪去有鉗子夾痕、扭曲、凝血塊、穿孔段后分離出10-15厘米一段。,30,幾種細胞培養(yǎng)方法舉例,臍靜脈血管內(nèi)皮細胞 用注射器吸取 Hanks液，充分清洗臍靜脈，用血管鉗夾緊臍帶一端，從另一端向臍靜脈管腔內(nèi)緩慢注入0.1I型膠原酶8

8、-10ml，靜脈充盈后，用另一只血管鉗夾住防膠原酶返流。置入37培養(yǎng)箱內(nèi)消化10分鐘。,以15X105個細胞的密度接種在適量DMEM或FAD培養(yǎng)液中，37培養(yǎng)1-3天，細胞貼壁后，沖洗未貼壁細胞。 傳代培養(yǎng)：0.05%-0.1%的EDTA孵育10-30min，細胞變圓后，在用0.1%的胰蛋白酶和0.05%EDTA消化，吸管吹打是細胞完全脫壁。,幾種細胞培養(yǎng)方法舉例,32,幾種細胞培養(yǎng)方法舉例,臍靜脈血管內(nèi)皮細胞 松開一端血管鉗，將含有內(nèi)皮細胞的消化液收集到離心管中，然后注入含10胎牛血清的RPMI1640培基終止消化并沖洗血管，以便獲取更多的內(nèi)皮細胞。,33,幾種細胞培養(yǎng)方法舉例,臍靜脈血管內(nèi)

9、皮細胞 將沖洗液一并注入離心管，以1000 rpm離心 l0分鐘，棄上清液，加RPMI 1640培養(yǎng)液，接種于50ml一次性塑料培養(yǎng)瓶中，置37培養(yǎng)箱內(nèi)，在5C02 24小時后換液一次，除去紅細胞和未貼壁的細胞繼續(xù)培養(yǎng)，隔兩天換液一次。,34,幾種細胞培養(yǎng)方法舉例,臍靜脈血管內(nèi)皮細胞,35,幾種細胞培養(yǎng)方法舉例,臍靜脈血管內(nèi)皮細胞,36,幾種細胞培養(yǎng)方法舉例,人滑膜細胞 將手術(shù)取下的新鮮的滑膜組織置于無菌的平皿中，剔除脂肪組織，用含青、鏈霉素的D-Hanks洗滌兩次，用眼科剪將滑膜組織充分剪碎，吸入螺口管中，1200rpm/min，離心10分鐘。,37,幾種細胞培養(yǎng)方法舉例,人滑膜細胞 離心后

10、，棄上清，加入一倍體積的0.4II型膠原酶，置于37 5CO2培養(yǎng)箱中消化60分鐘（每15分鐘吹打一次）。初次消化后，離心棄上清，再加入一倍體積的0.25胰蛋白酶繼續(xù)消化30分鐘。最后加入含15血清的RPMI1640培養(yǎng)液終止消化。,38,幾種細胞培養(yǎng)方法舉例,人滑膜細胞 消化后的細胞懸液經(jīng)200目的篩網(wǎng)過濾并離心洗滌兩次，再用含10小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液重懸細胞，接種于培養(yǎng)瓶中，置于375CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，輕輕去除仍懸浮的細胞，繼續(xù)培養(yǎng)，每3天換液一次,約10天左右可長滿瓶底。,39,幾種細胞培養(yǎng)方法舉例,人滑膜細胞 細胞長滿培養(yǎng)瓶后即可進行傳代培養(yǎng)，用0.05胰蛋白酶-

11、0.02EDTA消化后按幾種細胞培養(yǎng)方法舉例,40,幾種細胞培養(yǎng)方法舉例,人滑膜細胞,41,幾種細胞培養(yǎng)方法舉例,人滑膜細胞,42,幾種細胞培養(yǎng)方法舉例,乳鼠心肌細胞 分步消化法,對于股骨中骨髓細胞的分離，則可以采取沖洗股骨腔的方法獲得。,幾種細胞培養(yǎng)方法舉例,實驗材料,小鼠 小鼠的抓法： 從鼠籠內(nèi)將小鼠尾部抓住并提起，放在磁盤上或報紙上。,小鼠的處死：頸椎脫位法 右手（左手）抓住鼠尾用力向后拉，同時左手（右手）拇指與食指用力向下按住小鼠頭部，在顱骨基部的后側(cè)與頸椎兩側(cè)，施加壓力，使頭顱和腦一起與脊髓分離。當脊髓與腦分離時，伴有大量的肌肉活動。經(jīng)研究證明，這種方法能使實驗動物對痛覺不再敏感。,

12、股骨骨髓細胞懸液的制備,沖洗骨髓腔 ： 用剪刀剪開股骨的一端，將注射器針頭插入股骨開口端。然后用剪刀剪開股骨的另一端，用D-Hanks液多次沖洗骨髓腔，收集細胞懸液于離心管中。,47,主要內(nèi)容,培養(yǎng)細胞的取材 組織材料的分離 原代細胞培養(yǎng) 幾種細胞培養(yǎng)方法舉例 建立細胞系,48,建立細胞系,細胞系 初代培養(yǎng)物開始第一次傳代培養(yǎng)后的細胞，即稱之為細胞系。如細胞系的生存期有限，則稱之為有限細胞系（Finite Cell Line）；已獲無限繁殖能力能持續(xù)生存的細胞系，稱連續(xù)細胞系或無限細胞系（Infinite Cell Line）。,49,建立細胞系,細胞系 無限細胞系大多已發(fā)生異倍化，具異倍體核

13、型，有的可能已成為惡性細胞，因此本質(zhì)上已是發(fā)生轉(zhuǎn)化的細胞系。 無限細胞系有的只有永生性（或不死性），但仍保留接觸抑制和無異體接種致癌性；有的不僅有永生性，異體接種也有致瘤性，說明已惡性化。,50,建立細胞系,細胞株（Cell strain） 從一個經(jīng)過生物學鑒定的細胞系用單細胞分離培養(yǎng)或通過篩選的方法，由單細胞增殖形成的細胞群，稱細胞株。 由原細胞株進一步分離培養(yǎng)出與原株性狀不同的細胞群，亦可稱之為亞株。,51,建立細胞系,ATCC American Type Culture Collection 美國標準菌庫,52,建立細胞系,細胞入庫檢測項目 組織來源和已傳代數(shù)：應(yīng)說明細胞供體所屬物種，來自人或動物，個人性別、年齡、取材的器官和組織。腫瘤組織應(yīng)說明臨床和病理診斷及病歷號等。 培養(yǎng)條件及方法：說明使用培養(yǎng)基、血清種