移植免疫及免疫學(xué)檢測

1、,第二十八章 移植免疫及其免疫檢測,.,2,移植（transplantation）:將健康細胞、組織或器 官從其原部位移植到自體或異體的一定部位、用以 替代或補償機體所喪失的結(jié)構(gòu)和（或）功能的現(xiàn)代 醫(yī)療手段。 移植物（graft） 供 體（donor） 受 體（recipient）或宿主（host）,概 述,.,3,自體移植 根據(jù)移植物來源 同系移植 同種異體移植 異種移植 原位移植 根據(jù)移植部位 異位移植 器官移植 移植物種類 支架組織移植 細胞移植,移植的類型,.,4,組織器官移植種類和命名,移植名稱 供者、受者關(guān)系 舉例 自體移植 同一個體 自體斷肢再植，自體皮片移植 同系或同基因移植

2、同系或同基因 人的單卵雙生子間的器官移植 的個體間 同品系小鼠的皮片移植 同種異基因移植 同種不同基因 人與人之間的腎移植 的個體間 不同品系小鼠間的皮片移植 異種移植 異種動物間 狗的器官移植給猩猩 豬的器官移植給狗,第一節(jié) 引起排斥反應(yīng)的靶抗原,.,6,1 主要組織相容性抗原 人 HLA 鼠 H-2 遺傳特征： 單倍型遺傳 高度多態(tài)性 2 次要組織相容性抗原,主要組織相容性抗原（MHC分子）,.,7,父 母 HLA是人體多態(tài)性最豐富的基因系統(tǒng)。據(jù)1999年的統(tǒng)計，HLA復(fù)合物等位基因總數(shù)已達到1031個，其中HLA-B等位基因有301個,A9 Cw3 B7,A2 Cw2 B13,A1 Cw

3、1 B5,A3 Cw4 B8,HLA的遺傳特征,.,8,第二節(jié) 排斥反應(yīng)的種類及發(fā)生機制,.,9,移植排斥反應(yīng)（transplantation rejection）,針對移植抗原產(chǎn)生免疫應(yīng)答，從而導(dǎo)致移植物功能喪失或受者機體損害的過程。,分類： 超急性排斥反應(yīng) 急性排斥反應(yīng) 慢性排斥反應(yīng),.,10,機制： 受者體內(nèi)存有抗供者移植物的預(yù)存抗體，與抗原結(jié)合，激活補體和凝血系統(tǒng),導(dǎo)致血管內(nèi)凝血。 預(yù)存抗體來源： 1、供受者之間ABO 血型不合； 2、受者反復(fù)多次輸血、妊娠或既往作過移植。 處理：重新移植 預(yù)防：ABO血型配型、細胞毒實驗,1.超急性排斥反應(yīng),.,11,2. 急性排斥反應(yīng),體液性排斥

4、抗體激活補體，并有CD4+T 細胞參與，導(dǎo)致急性血管炎 細胞性排斥 CD8+CTL細胞的細胞毒作用、CD4+T和巨噬細胞的作用，導(dǎo)致急性間質(zhì)炎。 處理 使用免疫抑制劑,.,12,在急性排斥反應(yīng)中的兩條抗原提呈途徑： 直接途徑（direct path）:殘留于供者移植物內(nèi)的抗原提呈細胞（過客細胞）對受者機體的免疫系統(tǒng)提供最初的抗原刺激。這種抗原性刺激，來自移植物中樹突狀細胞和單核細胞等表面富含的HLA-、-類分子 間接途徑 （indirect path）:通過受者體內(nèi)的抗原提呈細胞對具有同種異基因HLA-、-類分子的移植物實質(zhì)細胞的識別。無論是供者還是受者，其抗原提呈細胞提供的IL-1、IL-6

5、等刺激信號，有助于觸發(fā)淋巴細胞的活化,.,13,同種移植排斥反應(yīng)的發(fā)生機制,.,14,慢性排斥反應(yīng)的介導(dǎo)因素： T細胞、巨噬細胞等介導(dǎo)的遲發(fā)型超敏反應(yīng)等免疫損傷。 B細胞產(chǎn)生的抗體活化補體或通過ADCC破壞血管內(nèi)皮細胞。 急性排斥反應(yīng)反復(fù)發(fā)作所導(dǎo)致的移植物組織退行性變，此與細胞 和體液免疫均有關(guān)系。 非免疫相關(guān)因素，諸如局部缺血、再灌注損傷、微生物感染等。 受者患有高血壓或糖尿病也可促使慢性排斥反應(yīng)的發(fā)生 臨床特征： 對免疫抑制療法不敏感 無特異性治療方法， 最終需要重新進行器官移植,3. 慢性排斥反應(yīng),.,15,定義：在骨髓移植時，供者骨髓中的免疫細胞啟動以受者細胞為靶抗原的免疫應(yīng)答反應(yīng)，引

6、起攻擊受者的移植物抗宿主反應(yīng)。GVHD也可見于脾、胸腺和小腸移植。 發(fā)生機制：T細胞起主要作用 IL-2、IL-6、TNF-、IFN-等 ICAM、VCAM、CD44、ELAM-1等,4. 移植物抗宿主反應(yīng),第三節(jié) HLA分型方法,血清學(xué)分型法,應(yīng)用一系列已知抗HLA的特異性標準分型血清與待測淋巴細胞混合，借助補體的生物學(xué)作用介導(dǎo)細胞裂解的細胞毒試驗。,操作簡便易行、 節(jié)約試劑、結(jié)果可靠、重復(fù)性好 無需特殊設(shè)備,優(yōu)點,缺點,耗時長 不同批號抗血清結(jié)果常有不同,.,18,用于HLA分型的微量細胞毒試驗,血清學(xué)分型法,.,20,.,21,細胞學(xué)分型法,以混合淋巴細胞培養(yǎng)（mixed lymphoc

7、yte culture,MLC）或稱混合淋巴細胞反應(yīng)（mixed lymphocyte reaction,MLR）為基本技術(shù)的HLA分型法。能用本法測定的抗原稱為LD抗原（lymphocyte defined antigen）,包括HLA-D、-DP。,1.單向MLC,原理：將已知HLA型別的分型細胞用絲裂霉素C或X線照射預(yù)處理，使其失去增殖能力僅作為刺激細胞；而以具有增殖能力的受檢者外周血單個核細胞為反應(yīng)細胞。兩者混合培養(yǎng)時，反應(yīng)細胞可對刺激細胞發(fā)生應(yīng)答而增殖，用3H-TdR摻入法測定細胞增殖強度，從而判斷受檢細胞的HLA型別。,根據(jù)選用的刺激細胞類型分為：,1陰性分型法,2陽性分型法,.,

8、22,遺傳型不同的兩個個體淋巴細胞在體外混合培養(yǎng)時，由于兩者HLA不同，能相互刺激導(dǎo)致對方淋巴細胞增殖，故稱雙向MLC。在此試驗中，各自的淋巴細胞既是刺激細胞，又是反應(yīng)細胞，反應(yīng)后形態(tài)上呈現(xiàn)的細胞轉(zhuǎn)化和分裂現(xiàn)象，可通過形態(tài)法計數(shù)轉(zhuǎn)化細胞 。,2.雙向MLC,.,23,分子生物學(xué)分型法,限制性片斷長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism, RFLP）分析：最早建立的研究HLA多態(tài)性的DNA分型技術(shù) PCR-RFLP分型法：對DNA片段進行體外擴增，然后再用限制性內(nèi)切酶進行酶切分析，可使限制性長度分析的敏感度大大增加,1. RFLP與PCR-RF

9、LP分型法,.,24,序列特異性寡核苷酸-聚合酶鏈反應(yīng)（PCR-sequence specific oligonucleotide, PCR-SSO）是以PCR為基礎(chǔ)，將凝膠上擴增的HLA基因DNA轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜或尼龍膜，進而用放射性核素或酶、地高辛等非放射性物質(zhì)標記的寡核苷酸探針與之進行雜交，從而對擴增產(chǎn)物作出HLA型別判斷。 分類： 斑點或印漬法：用擴增的待測DNA印漬或點至固相支持物，再與探針行雜交，利于大量標本分型 反向斑點或印漬法：將已知DNA印漬或點至固相支持物，然后與擴增的待測DNA（預(yù)先標記）雜交，用于少量標本分型 PCR-SSO是類HLA分型應(yīng)用最廣泛的方法， 能夠鑒定所有

10、已知序列的HLA-DR、DQ、DP等位基因,2. PCR-SSO分型法,.,25,基因芯片(gene chip)是近年發(fā)展起來的一項新技術(shù),將其與PCR-SSO結(jié)合應(yīng)用于HLA分型，可使分型趨于規(guī)?；妥詣踊绕湓贖LA多態(tài)性和疾病遺傳背景分析等方面更具優(yōu)勢。HLA的基因芯片分型法，實際上是PCR-SSO反向斑點或印漬法的微型化。目前，基因芯片在HLA分型領(lǐng)域的應(yīng)用尚屬起步階段。,2. PCR-SSO分型法,.,26,原理：應(yīng)用設(shè)計的一套HLA等位基因的序列特異性引物（sequence specific primer,SSP）,對待測DNA進行PCR擴增，從而獲得HLA型別特異性的擴增產(chǎn)物

11、HLA基因擴增的特異性包括： 座位特異性（locus-specific），如HLA-A、B、-DRB1等； 組特異性（group-specific），如DRB1-01、DRB1-02等； 等位基因特異性（allele-specific），如DRB1*0401、DRB1*0402等。,3. PCR-SSP分型法,.,27,單鏈構(gòu)象特異性聚合酶鏈反應(yīng)（PCR-single strand conformation polymorphism,PCR-SSCP）是以對待測基因PCR擴增為基礎(chǔ)，對擴增的單鏈DNA（ssDNA）的HLA分型方法。 原理：對ssDNA進行無變性劑的聚丙烯酰凝膠電泳時，因其序列

12、的差異可形成不同的空間構(gòu)象而導(dǎo)致電泳遷移率的差異，如此可分辨出單一堿基的差異和檢測出DNA多態(tài)性或點突變，有助于新的HLA等位基因或突變體的發(fā)現(xiàn)。 特點：PCR-SSCP作為PCR-SSO的補充，在區(qū)分純合子和雜合子基因方面有其獨到之處，有利于排除SSO雜交的假性。,4. PCR-SSCP分型法,.,28,基于序列的HLA分型法（sequence-based HLA typing,SBT），通過對擴增后的HLA基因片段通過核酸序列測定來判斷HLA型別。 基本過程：分離待測細胞的DNA，應(yīng)用座位、組或等位基因特異性引物進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物的純化和測序，測出的基因序列與HLA基因庫的DNA已知

13、序列比較，判斷待測的HLA型別。,5. SBT分型法,.,29,第四節(jié) 常見的組織或器官移植,.,30,腎臟移植,腎臟移植，創(chuàng)始于1950年，是臨床開展最早、應(yīng)用最多和效果最佳的一種器官移植。,1.組織配型在腎臟移植中的應(yīng)用,組織配型是腎臟移植前選擇供者的重要手段 ABO血型配型、 HLA配型和 交叉配型 腎源選擇的原則 以ABO血型完全相同者為好，至少能夠相容 選擇最佳HLA配型的供者器官,.,31,2.腎移植受者的療效檢測,療效監(jiān)測：受者免疫狀態(tài)檢測 臨床觀測項目: T細胞總數(shù)、CD4/CD8比值和IL-2及其受體的檢測，判斷排斥反 應(yīng)的發(fā)生和評估免疫抑制劑治療效果 腎組織活檢，預(yù)測排斥反

14、應(yīng)的發(fā)生 CsA血藥濃度檢測，指導(dǎo)合理用藥，減少腎毒性,.,32,肝臟移植,特點： HLA是否匹配與肝臟移植效果無顯著差異 機制：肝臟移植時，因HLA不配僅發(fā)生較弱的排斥反應(yīng)，而免疫抑制劑 的應(yīng)用有效控制了排斥反應(yīng)的發(fā)生 肝臟移植時仍應(yīng)盡可能進行HLA配型,1.組織配型在肝臟移植中的應(yīng)用,.,33,組織病理學(xué)特點：肝移植術(shù)后第2天，匯管區(qū)出現(xiàn)明顯的白細胞浸潤，匯管區(qū)和肝竇的白細胞浸潤第7天達高峰，涉及到T細胞、B細胞、巨噬細胞、嗜酸性和中性粒細胞。在浸潤的T細胞中CD8+細胞高于CD4+細胞，也見有IL-2R和CD25+的活化T細胞。 排斥反應(yīng)發(fā)生幾率：約2/3的肝移植患者出現(xiàn)過排斥反應(yīng)的病理

15、學(xué)改變，也有8的病例術(shù)后發(fā)生急、慢性排斥反應(yīng)，占肝移植致死原因的10%。,2.肝移植受者的療效檢測,.,34,心臟移植與心肺聯(lián)合移植,ABO血型匹配：避免急性排斥反應(yīng)的首要條件 HLA I、類分子匹配：移植器官長期存活的重要因素。 淋巴細胞毒交叉配合和群體反應(yīng)性抗體檢測,1.組織配型在心臟和心肺聯(lián)合移植中的應(yīng)用,.,35,免疫監(jiān)測指標： 外周血淋巴細胞總數(shù) T、B細胞的轉(zhuǎn)化能力 T細胞亞類百分數(shù)及比值 CTL細胞毒作用 細胞因子及其受體表達或轉(zhuǎn)錄水平 轉(zhuǎn)化生長因子 NK細胞數(shù)及其介導(dǎo)的自然殺傷或ADCC效應(yīng) 粘附分子及其配體在各類細胞表達情況,2.心臟及心肺聯(lián)合移植受者的療效檢測,.,36,骨

16、髓與其他來源的干細胞移植,特點：可同時發(fā)生HVGR和GVHR 分類： 自體骨髓移植、 同基因骨髓移植 同種異基因骨髓移植（多見）,1.骨髓移植,病例較少 成功率高,骨髓移植實際上是造血干細胞移植， 因此，骨髓中造血干細胞的質(zhì)和量對移植的成敗致關(guān)重要。,.,37,2.外周血和臍血干細胞移植,方法：使用藥物動員劑促使造血干細胞從骨髓釋放到外周血，從中獲取足量的干細胞用于移植，可獲得與骨髓移植同樣的治療目的 特點：與骨髓移植相比，具有采集方便、供者不需麻醉、移植后造血恢復(fù)快，GVHR發(fā)生率和嚴重程度不高等優(yōu)點。 移植前檢測：HLA和ABO血型配型、血常規(guī)與骨髓檢驗、性染色體測定、造血干細胞鑒定和GV

17、HR征象追蹤等,腫瘤干細胞的發(fā)現(xiàn)，提示人們在進行干細胞應(yīng)用時應(yīng)該注意生物安全性。,.,38,適應(yīng)于同種異型或異基因骨髓移植的疾病包括：再生障礙性貧血、慢性髓樣白血病等血液系統(tǒng)疾病，以及脊髓發(fā)育不良、嚴重聯(lián)合免疫缺陷病、Wiskott-Aldrich綜合征、慢性肉芽腫、X-性聯(lián)高IgM綜合征（CD40L缺陷）、骨骼石化癥等免疫缺陷性疾病。 乳腺、卵巢、睪丸以及肺部等實體瘤，不宜行骨髓移植，多應(yīng)用自體末稍血干細胞移植治療，而自體末稍血干細胞移植對再生障礙性貧血、慢性髓樣白血病和免疫缺陷病無效。 急性髓樣白血病、急性淋巴母細胞性白血病、多發(fā)性骨髓瘤、非何杰金淋巴瘤和何杰金病等，則既是同種異型或異基因

18、骨髓移植的適應(yīng)癥，也可用自體末稍血干細胞移植進行治療。,3.適于骨髓或末稍血干細胞移植的常見疾病,.,39,第五節(jié) 排斥反應(yīng)的預(yù)防與治療,.,40,組織配型,HLA是引起同種異型移植排斥反應(yīng)的主要抗原 供者與受者的HLA等位基因匹配程度決定了移植排斥反應(yīng)的強弱程度 通過HLA組織配型(tissue typing)，選擇合適的供者，減輕排斥反應(yīng),1.HLA配型,移植物存活與HLA配型的關(guān)系是： 供、受者HLA-A和HLA-B相配的位點數(shù)越多，移植物存活機率越高； 供、受者HLA-DR位點相配更重要，因為HLA-DR和DQ基因有很強的連鎖不平 衡，DR位點相配的個體，通常DQ位點也相配； 不同地區(qū)

19、HLA匹配程度與移植結(jié)果的關(guān)系有著不同的預(yù)測價值，在歐洲HLA 匹配的程度對移植結(jié)果的預(yù)測性比美國高，因為歐洲人群的近交程度較高 ，導(dǎo)致HLA位點連鎖不平衡性削弱。,.,41,交叉配型采用補體依賴的細胞毒試驗 陽性對照:陽性對照血清可用淋巴細胞免疫家兔獲得 陰性對照:陰性血清可采用無受血史的AB血型男性血清 根據(jù)反應(yīng)時參與的細胞成分分類： 淋巴細胞交叉配型 T細胞淋巴細胞毒性交叉配型 B細胞淋巴細胞毒性交叉配型 流式細胞法交叉配型 自身交叉配型 結(jié)果判度: 交叉配型陽性:表明受者預(yù)存有抗供體的抗體 臨床意義: 交叉配型陽性:即使組織配型好，也不宜進行移植，易發(fā)生超急性排斥反應(yīng)。 在做受體選擇時

20、，組織配型差，但交叉配型為陰性，仍可實施移植。 交叉配型常用于腎臟移植,2.HLA交叉配型與預(yù)存抗體的檢測,.,42,CML：細胞介導(dǎo)的淋巴細胞溶解試驗,.,43,群體反應(yīng)性抗體（panel reactive antibody,PRA）：指用40-60人含已知HLA的T細胞或T、B混合細胞，檢測待移植受者血清所得到的抗體陽性百分數(shù)。 檢測意義: 用于判斷器官移植時受體的敏感程度 高PRA血清:可針對多個HLA抗原發(fā)生反應(yīng)，受體對所接受的移植器 官或組織威脅大 注意:應(yīng)考慮在不同HLA上可能出現(xiàn)的共同表位或稱公共抗原（public antigens）與受體血清發(fā)生的交叉反應(yīng),3.群體反應(yīng)性抗體的

21、檢測,1.移植物的預(yù)處理,不同的組織器官的移植，其移植物的處理不盡相同 首先是從移植術(shù)的角度對離體組織器官進行外科修整，然后根據(jù)不同器官的要求采取相應(yīng)的預(yù)處理,移植物與受體的預(yù)處理,.,45,組織配型或交叉配型 移植前應(yīng)用一定劑量的免疫抑制劑，其用量視組織配型的結(jié)果而定 術(shù)前輸血,視患者的需要進行,受體的準備,.,46,人工調(diào)節(jié)受者機體的免疫狀態(tài)是控制移植術(shù)后排斥反應(yīng)發(fā)生的主要途徑 采取的措施有： 使用免疫抑制劑:以此控制受者的免疫應(yīng)答，降低對移植物的排斥能力 誘導(dǎo)免疫耐受:誘導(dǎo)受者對移植抗原的特異性免疫耐受,免疫抑制措施,.,47,參與移植排斥反應(yīng)的免疫細胞以T細胞為主， T細胞功能抑制分類

22、：,1.免疫抑制劑的應(yīng)用,1、化學(xué)性免疫抑制劑,3、生物性免疫抑制劑,2、某些中草藥,環(huán)孢菌素A(cyclosporine A，CsA) 糖皮質(zhì)激素， 硫唑嘌呤， 環(huán)磷酰胺， FK506又名他克莫司(tacrolimus)， 霉酚酸酯(mycophendate mofetil, MMF),抗淋巴細胞球蛋白(ALG)或抗胸腺細胞球蛋白(ATG), 細胞性單克隆抗體， 某些融合蛋白, 反義寡核苷酸(antisence oligonucleotide),.,48,常見免疫抑制劑作用位點,.,49,新的研究思路： 誘導(dǎo)同種抗原的特異性免疫耐受:通過將同種抗原置入子宮或注射給新生兒而誘導(dǎo) 誘導(dǎo)免疫耐受:

23、應(yīng)用大劑量天然可溶性或人工合成的供者HLA分子，封閉同種抗原特異性T細胞的TCR，以誘導(dǎo)受者特異性T細胞凋亡，產(chǎn)生免疫耐受 誘導(dǎo)T細胞無能：使用可溶性CTLA-4以阻斷移植物細胞的B7與受者T細胞表面CD28的結(jié)合，干擾共刺激信號的形成。CTLA-4與IgFc段的融合蛋白也具有相似的作用 阻礙T細胞活化：阻斷CD40-CD40L、CD2-LFA3等膜分子的相互作用 誘導(dǎo)特異性耐受：借助基因工程技術(shù)，制備基因修飾的免疫細胞 T細胞疫苗（T cell vaccine,TCV）：誘導(dǎo)抗獨特型抗體的產(chǎn)生，破壞針對移植物的特異性T細胞，誘導(dǎo)免疫耐受。,2.對移植抗原特異性免疫耐受誘導(dǎo),.,50,第六節(jié)

24、排斥反應(yīng)的免疫監(jiān)測,.,51,體液免疫與細胞免疫水平檢測的臨床意義,特異性抗體水平的檢測 相關(guān)免疫指標： ABO等血型和HLA抗體 抗供者組織細胞抗體 血管內(nèi)皮細胞抗體 冷凝集素 測定方法: 交叉配型、補體依賴的細胞毒性試驗 血清PRA水平:判斷器官移植時受體對移植物的敏感程度， 基于細胞毒性試驗的PRA測定，被作為心臟移植前的常規(guī)項目， 若PRA超過5，則應(yīng)進行供者淋巴細胞與受者血清的交叉配型，,1.體液免疫水平檢測的臨床意義,.,52,補體水平的檢測 補體活性與急性移植排斥反應(yīng)的發(fā)生有關(guān) 當移植物遭受排斥時，補體成分的消耗增加 可采用溶血法或比濁法進行檢測。 補體活性的檢測 補體的裂解產(chǎn)物

25、，如C3a、C3b、C3d等的測定 常用的檢測方法有免疫電泳、免疫標記技術(shù),.,53,2.細胞免疫水平檢測的臨床意義,外周血T細胞及其亞類的計數(shù) 免疫熒光法或流式細胞儀測定T細胞及其亞群， 在急性排斥反應(yīng)臨床癥狀出現(xiàn)前15天，T細胞總數(shù)和CD4/CD8比值升高，巨細胞病毒感染時此比值降低。 CD4/CD8比值大于1.20時:預(yù)示急性排斥即將發(fā)生， CD4/CD8比值小于1.08時:發(fā)生感染的可能性很大。 若進行動態(tài)監(jiān)測，對急性排斥反應(yīng)和感染具有鑒別診斷的意義 NK細胞活性測定 免疫抑制劑抑制了受者機體殺傷細胞的活性，但在急性排斥時明顯升高 混合淋巴細胞反應(yīng): 刺激細胞:滅活的供者的淋巴細胞 反應(yīng)細胞:受者淋巴細胞 結(jié)果顯示的是CTL和NK細胞共同作用的結(jié)果。 動態(tài)監(jiān)測NK細胞活性則意義更大,.,54,血清細胞細胞因子測定 IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IFN-等細胞因子的水平均可升高 個體間血清IL-2R的含量差別顯著 粘附分子及其配體的檢測 免疫細胞以及血管內(nèi)皮細胞等細胞膜表面