微生物實(shí)驗(yàn).ppt

1、微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)?zāi)夸?實(shí)驗(yàn)一：顯微鏡的使用，微型動(dòng)物的計(jì)數(shù)，微生物形 態(tài)觀察 實(shí)驗(yàn)二: 微生物大小的測(cè)定，各菌種的觀察，油鏡的 使用 實(shí)驗(yàn)三：培養(yǎng)基的制備、滅菌、接種培養(yǎng)及純種分離 實(shí)驗(yàn)四：微生物的染色方法（革藍(lán)氏染色法） 實(shí)驗(yàn)五：純培養(yǎng)菌種的菌體菌落形態(tài)觀測(cè)，染色菌體 的觀察,顯微鏡的使用，微型動(dòng)物的計(jì)數(shù)，微生物形態(tài)觀察,實(shí)驗(yàn)一,熟悉光學(xué)顯微鏡基本結(jié)構(gòu)和用途； 掌握低倍鏡、高倍鏡使用方法; 掌握使用顯微鏡觀察微生物的形態(tài)； 掌握微生物直接計(jì)數(shù)法中常用的方 法血球計(jì)數(shù)法 學(xué)習(xí)血球計(jì)數(shù)器的構(gòu)造、原理及使用方法,一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?顯微鏡 玻片標(biāo)本 酵母菌 載玻片、蓋玻片、擦鏡紙 血球計(jì)數(shù)板 待測(cè)水樣 無菌

2、毛細(xì)管，吸水紙,二、實(shí)驗(yàn)器材,機(jī)械系統(tǒng)部分 光學(xué)系統(tǒng)部分 照明系統(tǒng)部分,1.光學(xué)顯微鏡的構(gòu)造,三、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,（一）光學(xué)顯微鏡的使用,機(jī)械部分,光學(xué)系統(tǒng)部分,“5”，“10”的含義。目鏡指針,如何計(jì)算顯微鏡的放大倍數(shù)？,照明系統(tǒng)部分,光 源,反光鏡,聚光鏡,光 圈,： 內(nèi)光源與外光源,： 凹面鏡與平面鏡,： 升高與降低聚光鏡,： 放開與關(guān)閉光圈,如何調(diào)節(jié)觀察視野的明暗度？,2.光學(xué)顯微鏡的使用,取鏡 放鏡 對(duì)光 放片 調(diào)焦(粗調(diào)焦和細(xì)調(diào)焦),低倍鏡的使用,高倍鏡的使用,問題思考：對(duì)顏色深的標(biāo)本與顏色淺的標(biāo)本在觀察過程中有何不同？,3.顯微鏡使用注意事項(xiàng),顯微鏡持取正確姿勢(shì) 使用前后的鏡頭維護(hù) 注

3、意標(biāo)本的放置方向 觀察時(shí)注意雙目齊睜 高倍鏡不得使用粗調(diào) 嚴(yán)禁拆卸任何部件 使用后恢復(fù)機(jī)器原貌,(二)微型動(dòng)物的計(jì)數(shù)基本原理,利用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下直接計(jì)數(shù)，直觀、快速。將經(jīng)過適當(dāng)稀釋的菌懸液放在血球計(jì)數(shù)板與蓋玻片之間的計(jì)數(shù)室中，在顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)。由于計(jì)數(shù)室的容積是一定的，可根據(jù)觀察到的數(shù)目換算成單位體積的總數(shù)目，此法計(jì)得的是菌的總數(shù)，故稱總菌計(jì)數(shù)法。,血球計(jì)數(shù)板,血球計(jì)數(shù)板,血球計(jì)數(shù)板,血球計(jì)數(shù)板刻有兩方格網(wǎng)，每網(wǎng)分九大方格，中間為計(jì)數(shù)室。計(jì)數(shù)室為2516（1625）小方格。計(jì)數(shù)時(shí)常數(shù)五個(gè)中格的總數(shù)，換算出1ml中的總菌數(shù)。,操作步驟,稀釋：將水樣進(jìn)行適當(dāng)稀釋，菌液不濃，可不必稀釋。 鏡

4、檢計(jì)數(shù)室：在計(jì)數(shù)前，先對(duì)計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室進(jìn)行鏡檢。若有污物，則進(jìn)行清洗。 加樣品：蓋上蓋玻片，用毛細(xì)管將菌液由蓋玻片邊緣滴一小滴，讓其自行滲進(jìn)計(jì)數(shù)室。不可有氣泡。,4 顯微鏡計(jì)數(shù)：先低倍鏡找計(jì)數(shù)室，后高倍鏡計(jì)數(shù)。一般以每小格510個(gè)菌體為宜。常選四角和中央五個(gè)中格計(jì)數(shù)。格線上菌體只數(shù)上線和左邊線。同法計(jì)另一室。 5 清洗血球計(jì)數(shù)板：自來水沖洗，切勿用硬物洗刷，自行涼干。鏡檢，洗凈為止。 記錄 7 計(jì)算,計(jì)數(shù)時(shí)，若采用一大方格為25個(gè)中方格的血球計(jì)器，5個(gè)中方格的總菌數(shù)設(shè)為A，菌液稀釋倍數(shù)為B，則1mL溶液中的總菌數(shù)（個(gè)）為： A/525104B5104AB 因?yàn)?1mL1cm31000mm3 如

5、果是16個(gè)中方格，設(shè)5個(gè)中方格的總菌數(shù)為A1，菌液稀釋倍數(shù)為B，則1mL溶液中的總菌數(shù)（個(gè)）為： A1/516104B3.2104A1B,（三）微生物形態(tài)觀察,結(jié)合教材P139145圖記錄幾個(gè)典型的所觀察到的微生物形態(tài)簡(jiǎn)圖,微生物大小的測(cè)定，各菌種的觀察， 油鏡的使用,實(shí)驗(yàn)二,一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1）學(xué)習(xí)用測(cè)微尺測(cè)量微生物細(xì)胞大小。 2）掌握臺(tái)鏡測(cè)微尺和目鏡測(cè)微尺的使用方法。,二、材料與儀器,1、待觀察水樣 2、顯微鏡、物鏡測(cè)微尺、目鏡測(cè)微尺,微生物細(xì)胞大小，是其形態(tài)特征重要標(biāo)志之一。每一種微生物在一定條件下，有其相對(duì)固有的大小形態(tài)。它是分類鑒定的依據(jù)之一。其大小測(cè)定可用測(cè)微尺測(cè)量。測(cè)微尺分為目鏡測(cè)

6、微尺和物鏡測(cè)微尺兩部分。,三、基本原理,目鏡測(cè)微尺：是一塊可以放入接目鏡內(nèi)的特定圓形玻璃片。玻片中央是一個(gè)細(xì)長(zhǎng)帶刻度的尺，等分成50或100小格，每個(gè)等分線間距為0.1mm。由于不同顯微鏡的放大倍數(shù)不同，故目鏡測(cè)微尺每格實(shí)際代表長(zhǎng)度隨顯微鏡的不同而不同。因此在使用前必須用物鏡測(cè)微尺校正，以求得在一定接物鏡及目鏡等光學(xué)系統(tǒng)下，目鏡測(cè)微尺每格所代表的實(shí)際長(zhǎng)度。,物鏡測(cè)微尺是一塊中央部分刻有精確等分線的載玻片。每一刻度間距為10um即把1mm等分為100格，是專門為校正目鏡測(cè)微尺實(shí)際數(shù)值用的。,物鏡測(cè)微尺,四、方法與步驟,1、目鏡測(cè)微尺的校正 1）將目鏡測(cè)微尺裝入目境內(nèi)，刻度朝下，并將物鏡測(cè)微尺朝上

7、置載物臺(tái)上。 2）用低倍鏡核對(duì)，至能清晰看到物鏡測(cè)微尺。 3）改用高倍鏡或油鏡對(duì)焦后，轉(zhuǎn)動(dòng)目鏡，使目鏡測(cè)微的刻度和物鏡測(cè)微尺刻度平行。 4)兩尺吻合后，先使兩尺的一端某一刻度完全重合，然后再尋找另一端第二條重疊的刻度。,5)計(jì)下兩吻合刻度間，目鏡測(cè)微尺與物鏡測(cè)微尺的格數(shù)。按下列公式算出目鏡測(cè)微尺每小格所代表長(zhǎng)度。 目鏡測(cè)微尺每格長(zhǎng)度（微米） 兩吻合刻度間物鏡測(cè)微尺格數(shù)10m = 兩吻和刻度間目鏡測(cè)微尺格數(shù) 例如：目鏡測(cè)微尺的5格等于物鏡測(cè)微尺的2格，則目鏡測(cè)微尺1格=（210）/5=4微米,2、微生物大小測(cè)定：,1）制作水樣浸片 2)取下鏡臺(tái)測(cè)微尺，將“水浸片”標(biāo)本置于載物臺(tái)上。 3）先用低倍

8、鏡觀察到目標(biāo)后，轉(zhuǎn)換高倍鏡測(cè)量酵母的大小，測(cè)量1020個(gè)菌體，求出其平均值。,四、測(cè)量結(jié)果記錄：,目鏡測(cè)微尺格=物鏡測(cè)微尺格 目鏡測(cè)微尺1格= 微米 微生物長(zhǎng)度=目鏡測(cè)微尺平均格 = 微米 寬度=目鏡測(cè)微尺平均格 = 微米 注：要求測(cè)量10個(gè)微生物的平均值,培養(yǎng)基的制備、滅菌、接種培養(yǎng)及純種分離,實(shí)驗(yàn)三,一、目的與要求,了解培養(yǎng)基的配制原理，掌握制備培養(yǎng)基的過程。 了解高壓蒸汽滅菌操作技術(shù)。 了解干熱滅菌操作要點(diǎn)。 學(xué)習(xí)從自然界中分離、培養(yǎng)微生物的方法。 學(xué)習(xí)制備平板及接種等無菌操作技術(shù)。,二、實(shí)驗(yàn)原理:,培養(yǎng)基是按照微生物生長(zhǎng)繁殖所需要的各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，用人工方法配制而成的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)。一般來說，

9、培養(yǎng)基包括有水份、碳源、氮源、無機(jī)鹽類以及生長(zhǎng)因素等五大類營(yíng)養(yǎng)成份。此外還得有適宜的pH值，一定的滲透壓（即濃度）以及氧化還原電位等。,滅菌：即通過不同的加熱方法，使微生物體內(nèi)蛋白質(zhì)凝固變性，從而達(dá)到滅菌的目的,蛋白質(zhì)的凝固變性與蛋白質(zhì)中含水量的多少有關(guān)，含水量較多者，其凝固所需要的溫度低，反之，含水份較少者需要高溫才能使蛋白質(zhì)凝固。因此殺滅芽孢比殺滅營(yíng)養(yǎng)體所需的溫度高。 利用目的菌的生理特征，將菌從微生物群體中篩選出來，并進(jìn)行分離培養(yǎng)，獲得純種。,三、實(shí)驗(yàn)方法,1.玻璃器皿的滅菌： 干熱滅菌：適用于玻璃儀器，將物品放入烘箱，160170oC，12小時(shí)。 2. 培養(yǎng)基的配制 察氏培養(yǎng)基、牛肉膏

10、蛋白胨培養(yǎng)基 3. 培養(yǎng)基的滅菌 高壓蒸汽滅菌,1.稀釋平板分離法 (1) 取樣 (2) 稀釋水樣 (3) 平板制作,三、實(shí)驗(yàn)方法,2. 平板劃線分離法,(1) 倒平板: (2) 劃線：,2. 平板劃線分離法,(1) 倒平板: (2) 劃線：,微生物的染色方法（革藍(lán)氏染色法）,實(shí)驗(yàn)四,一 目的和要求：,1、掌握革蘭氏染色的原理及方法 2、初步掌握無菌操作技術(shù),二、實(shí)驗(yàn)用品,菌種 試劑：結(jié)晶紫染液；蕃紅染液； 碘液；95乙醇 其它：顯微鏡；載玻片；接種環(huán)； 香柏油；酒精燈；擦鏡紙,三、 基本原理：,革蘭氏染色法是1884年由丹麥病理學(xué)家Christain Gran 創(chuàng)立的。 細(xì)菌對(duì)革蘭氏染色的不

11、同反應(yīng)是由于它們細(xì)胞壁的成分和結(jié)構(gòu)不同而造成的。 革蘭氏陽性菌的細(xì)胞壁主要由肽聚糖形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)組成，壁厚、類脂質(zhì)含量低。 革蘭氏陰性菌其細(xì)胞壁肽聚糖層較薄、類脂質(zhì)含量高。,四、實(shí)驗(yàn)步驟,1、涂片：將樣品分別涂片、干燥、固定 2、染色： （1）初染：加草酸銨結(jié)晶紫一滴，約一分鐘，水洗 （2）媒染：滴加碘液沖去殘水，并覆蓋一分鐘，水洗 （3）脫色：將水甩凈，并襯以白背景，用95%乙醇滴洗至剛剛無紫色為止，約2030秒，立即用水沖凈乙醇 （4）復(fù)染：用番紅液染1-2分鐘，水洗 3、鏡檢：干燥后，油鏡觀察。以分散開的細(xì)菌顏色為準(zhǔn)，革蘭氏陽性菌呈紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。 4、混合制片觀察：一載玻片上兩種菌混合制片，對(duì)比觀察。,經(jīng)此法染色后，細(xì)胞保留初染劑藍(lán)紫色的細(xì)菌為革蘭氏陽性菌；細(xì)胞中初染劑被脫色劑洗脫而染上復(fù)染劑的顏色（紅色）的細(xì)菌為革蘭氏陰性菌。,大腸桿菌（G-）,八疊球菌（ G +）,純培養(yǎng)菌種的菌體菌落形態(tài)觀測(cè)，染色菌體的觀察,實(shí)驗(yàn)五,1菌落形態(tài)特征的觀察,觀察平板上菌落的形態(tài)、結(jié)構(gòu)