酶類藥物的分析

1、1,酶類藥物的分析,第一節(jié) 概述 第二節(jié) 酶類藥物的鑒別與檢查 第三節(jié) 酶活力測定方法 第四節(jié) 酶活力測定方法設(shè)計 第五節(jié) 典型酶類藥物的檢測,2,。,3,第一節(jié) 概述,在生物體內(nèi)，降低反應(yīng)活化能，加快可逆反應(yīng)的進行速度。 一、酶的特性 二、酶的分類 三、酶的化學(xué)組成 四、酶的催化反應(yīng)機制 五、酶催化反應(yīng)動力學(xué),4,一、酶的特性,1酶是高效催化劑。 2酶對底物的結(jié)構(gòu)具有嚴格的選擇性。 （1）相對專一性： 脂肪水解酶，蛋白水解酶 （2）絕對專一性: 脲酶 （3）立體異構(gòu)專一性: L-氨基酸氧化酶 3酶催化反應(yīng)的反應(yīng)條件溫和。 4酶的催化活性在生物體內(nèi)受多種因素的調(diào)節(jié)。,5,。,5,6,二、酶的分

2、類,氧化還原酶 轉(zhuǎn)移酶 水解酶 裂合酶 異構(gòu)酶 合成酶（或稱連接酶）,7,三、酶的化學(xué)組成,分為簡單酶和結(jié)合酶兩大類。 結(jié)合酶類中除含有蛋白外，還含有某種熱穩(wěn)定的非蛋白質(zhì)的小分子物質(zhì)，二者結(jié)合起來，稱為“全酶”，才呈現(xiàn)生物催化活性。 結(jié)合酶 = 酶蛋白 + 輔助因子,8,四、酶的催化反應(yīng)機制,1酶-底物復(fù)合物的形成 在酶促反應(yīng)中，反應(yīng)底物首先與酶分子上活性部位結(jié)合，形成酶-底物復(fù)合物，降低反應(yīng)的活性能，使酶促反應(yīng)順利進行。 2酶-底物復(fù)合物加速反應(yīng)速率的原因 （1）定向作用與底物濃縮 （2）酶使底物分子變形 （3）酸堿催化 （4）共價催化 。,9,五、酶催化反應(yīng)動力學(xué),酶的活力單位 酶活性單位

3、（U）是酶活性高低的一種量度，用U/g或U/ml表示。 酶活力單位定義：在規(guī)定的條件下，每分鐘能轉(zhuǎn)化1mol底物所需要的酶量，稱一個酶的活力單位。 酶的比活力 每毫克酶蛋白所含酶活力，U/mg。,10,Michaelis-Menten快速平衡學(xué)說,底物濃度的增加，反應(yīng)速度上升呈雙曲線。 在低底物濃度時，反應(yīng)速度呈直線上升，表現(xiàn)為一級反應(yīng)。 在高濃度時，反應(yīng)速度達到一個極限值，呈現(xiàn)零級反應(yīng)。,11,米氏方程,酶反應(yīng)動力學(xué)方程式： V反應(yīng)初速度 Vm最大反應(yīng)速度 Ks 米氏常數(shù)，Ks=K1/K1， Ks為ES的解離常數(shù)，表示酶與底物的親和力。 Ks為反應(yīng)速度V是最大反應(yīng)速度Vm一半時所需底物濃度，

4、即V=1/2 Vm時，Ks=S。,12,Briggs-Haldane穩(wěn)態(tài)學(xué)說,ES的形成速度與ES的解離速度相等，達到動態(tài)平衡，即“穩(wěn)態(tài)”，反應(yīng)方程式： Km取代了Ks，當V=1/2 Vm時，Km=S。 Km也表示為底物與酶的親和力。,13,2015版藥典收載的酶原料,胰酶，胃蛋白酶 胰蛋白酶，糜蛋白酶，玻璃酸酶 尿激酶 抑肽酶，門冬酰胺酶,中國藥典收載的酶類藥品品種,15,第二節(jié) 酶類藥物的鑒別與檢查,鑒別方法: 蛋白質(zhì)鑒別方法，如在堿性條件下的雙縮脲反應(yīng)。 SDS-PAGE電泳：降纖酶 HPLC：門冬酰胺酶 專用于酶的鑒別方法： 酶活性試驗：與特異性底物反應(yīng)（胰蛋白酶）。 沉淀試驗：胃蛋白

5、酶 動物試驗：透明質(zhì)酸酶水解粘多糖。,16,酶類藥物的檢查,酶類藥物是生化產(chǎn)品和微生物發(fā)酵產(chǎn)品，在生產(chǎn)過程中可能帶入微量的脂肪類物質(zhì)、其他的酶類和大分子雜質(zhì)，影響酶質(zhì)量，需有含量限度。,17,酶類藥物的檢查,（一）脂肪含量限度檢查 檢查方法，乙醚浸提，干燥，精密稱定，脂肪不得過規(guī)定的含量。 （二）其他酶類含量限度檢查 胰蛋白酶、糜蛋白酶均是從牛、豬的胰臟中提取的蛋白分解酶。提取胰蛋白酶時又易帶入微量的糜蛋白酶。 （三）大分子活性物質(zhì)含量限度檢查,18,胰蛋白酶制品中糜蛋白酶的含量,每2500U胰蛋白酶中不得多于50U的糜蛋白酶。 糜蛋白酶專屬水解芳香氨基酸（L-酪氨酸、L-苯丙氨酸）的羧基形成

6、的肽鍵、酰胺鍵和酯鍵。 用N-乙酰-L-酪氨酸乙酯（N-Acetyl-L-Tyrosine Ethylester，ATEE）作底物，通過分光光度法測定此酶對底物的水解速率來檢查該酶的含量限度。,19,第三節(jié) 酶活力測定方法,固定時間法 連續(xù)監(jiān)測法 固定濃度法,20,一、固定時間法 （終點法）,在適宜的條件下，使酶和底物共同保溫一定時間，測定產(chǎn)物生成的量或底物消耗的量，計算出酶的含量（或活力）。 E表示酶濃度，P為反應(yīng)產(chǎn)物濃度，t 表示酶作用時間，K為常數(shù)。,21,實例：,（1）胰彈性蛋白酶活力單位定義：在pH 8.8，37條件下作用20min，水解1.0mg剛果紅彈性蛋白的酶量定義為一個活力單

7、位。 （2）天冬氨酸酶活力單位定義：在測定條件下，每小時每克細胞轉(zhuǎn)化生成1mol天冬氨酸所需的酶量。,22,注意事項,缺點：無法了解整個反應(yīng)過程是否都是零級反應(yīng)。 注意事項： 1、底物飽和 2、時間,23,二、連續(xù)監(jiān)測法（反應(yīng)速度法）,在酶反應(yīng)過程中，連續(xù)記錄不同時間的底物消耗量或產(chǎn)物生成量。 酶底物大多是人工合成的“色素元”，其本身無色，經(jīng)酶作用后釋放出有色的反應(yīng)產(chǎn)物。根據(jù)反應(yīng)過程中吸收度增高速率，算出酶活力單位。 測定時間. 例如： 磷酸對硝基苯酚酯 對硝基苯酚 法,下文為中國藥典2015版胰蛋白酶活力測定方法，請仔細閱讀，并闡述此酶活力測定的原理？其酶活力測定方法屬于哪一種？胰蛋白酶作用

8、位點有哪些？寫出測定所用底物的英文縮寫？,供試品的制備：精密稱取本品適量，用鹽酸（0.001mol/L）制成每1ml中含5060胰蛋白酶單位的溶液。 底物溶液的制備：取N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯鹽酸鹽85.7mg，加水溶解使成100ml，作為底物原液；底物溶液應(yīng)在制成后2小時內(nèi)使用。 測定法：取底物溶液3.0ml，加鹽酸溶液（0.001ml/L）0.2ml，混勻，作為空白，取供試品溶液0.2ml加底物溶液（預(yù)熱至250.5）3.0ml，立即計時并搖勻，使比色池內(nèi)溫度保持在250.5，照紫外可見分光光度法在253nm的波長處，每隔30秒種讀取吸收度，共5分鐘。每30秒鐘吸收度的變化率應(yīng)恒定在0.

9、0150.018之間，呈線性關(guān)系的時間不得少于3分鐘。若不符合上述要求，應(yīng)調(diào)整供試品的溶液濃度，另行測定。以吸收度為縱坐標，時間為橫坐標做圖，取在3分鐘內(nèi)成直線部分的吸收度，按下式計算。 式中 P為每1mg供試樣品中胰蛋白酶的單位數(shù)； A1為直線上終止的吸收度；A2為直線上開始的吸收度； T為A1至A2讀數(shù)的時間（分）；W為測定液中供試品的量； 0.003為上述條件下，吸收度每分鐘改變0.003相當于一個胰蛋白酶單位。,25,三、固定濃度法 （fixed-concentration essay）,根據(jù)酶催化反應(yīng)，使反應(yīng)產(chǎn)物達到額定的濃度時其反應(yīng)時間與酶濃度成反比的原理進行設(shè)計的。 P=KEt

10、以所需時間的倒數(shù)（1/t）對酶濃度作圖即可制備標準曲線。 優(yōu)點：1、記錄時間。2、準確,26,第四節(jié) 酶活性測定方法的設(shè)計,一、影響因素 二、底物與產(chǎn)物的測定方法 三、測定條件的選擇,27,一、影響因素,1、底物 2、pH 3、溫度 4、酶濃度 5、空白和對照,28,底物,酶可以同時作用多個底物。 以Km最小者作為此酶的生理底物。 從底物性質(zhì)看，選用的底物最好在物理化學(xué)性質(zhì)上與產(chǎn)物不同，利于測定。 從底物濃度看，為不使酶反應(yīng)受到它的控制，反應(yīng)系統(tǒng)應(yīng)使用足夠高的底物濃度。,29,胰凝乳蛋白酶幾種底物的Km,30,底物濃度對酶反應(yīng)速度的影響,31,pH,酶活力測定選用緩沖體系。 不同緩沖液所受影響

11、不同。磷酸鹽所受影響較小，而Tris則受影響較大。 酶溶液用量與底物溶液比例不超過10為宜。,32,溫度,溫度變化1 ，反應(yīng)速度可能相差10以上，控制在 0.1 。 反應(yīng)溫度一般為25 ，此時酶不易滅活，Km較小，可以使用較低的底物濃度。 有些酶在37 不穩(wěn)定。,33,酶濃度,酶樣要充分稀釋。 取3個不同酶量測得的產(chǎn)物量和酶濃度之間為正比關(guān)系，這樣的酶濃度范圍就是適當?shù)摹?34,空白和對照,空白：指雜質(zhì)反應(yīng)或自發(fā)反應(yīng)引起的變化量，代表未知因素的影響。 分為完全空白（如測定時要終止反應(yīng)，則空白可先加終止反應(yīng)試劑再加酶）。 酶空白 底物空白,35,二、底物與產(chǎn)物的測定方法 （酶反應(yīng)的檢測方法）,1

12、、化學(xué)方法：用化學(xué)法測定其中某一底物或產(chǎn)物的變化值。 2、分光光度法： 常用的有比色法和紫外分光光度法。 3、熒光測定法： 簡單、靈敏、快速。 4、電化學(xué)分析法 （1） 離子選擇性電極分析法 （2） 微電流法 5、其他方法 如測定氣體的測壓法，測定產(chǎn)物旋光度變化值的旋光測定法。,酶活力測定反應(yīng)的檢測方法 按照酶法分析方法測定酶活性時，需要跟蹤酶促反應(yīng)中某一反應(yīng)底物或產(chǎn)物的濃度隨時間發(fā)生的變化量（速度法），或測量酶促反應(yīng)中反應(yīng)產(chǎn)物或底物濃度的總變化量（終點法）?？舍槍δ承┮子跍y定的酶促反應(yīng)底物或產(chǎn)物選擇具體的檢測方法，包括容量分析法、氣體檢測法、光學(xué)檢測法、黏度測定法、酶聯(lián)免疫法等。 分光光度法

13、 若酶促反應(yīng)中，反應(yīng)底物或產(chǎn)物之一由于化學(xué)結(jié)構(gòu)的改變，其吸光度的強度發(fā)生變化，可以通過測定該酶促反應(yīng)系統(tǒng)的光吸收度的變化量，推算出酶的活力。多數(shù)酶類藥物的含量檢測（效價測定）均采用分光光度法，如胃蛋白酶、糜蛋白酶、門冬酰胺酶、溶菌酶等。,37,三、測定條件的選擇,1、單因素選擇 2、正交設(shè)計多因素選擇,38,1、單因素選擇比色法測溶菌酶活性,以染料艷紅K-2BP標記的MLysodeikticus為底物，分解后產(chǎn)生游離染色碎片（產(chǎn)物） 離心除去未分解底物，上清液比色 吸收度為溶菌酶活力的函數(shù)。,39,測定條件選擇S pH,（1）酶反應(yīng)底物濃度曲線 以染料標記的MLysodeikticus為底物，

14、酶量為20g時，1%底物濃度已接近使酶飽和。 （2）酶反應(yīng)PH曲線 磷酸緩沖液和檸檬酸磷酸緩沖液。 不同組分的緩沖液，其最適PH稍有不同，選用pH6.5磷酸緩沖液。,40,測定條件選擇離子強度 、反應(yīng)時間及E,（3）離子強度對酶反應(yīng)的影響 離子強度在0.3mol/L以上為宜，選用0.5mol/L。 （4）酶反應(yīng)過程曲線(反應(yīng)時間)和酶濃度曲線 酶量為20 g時，反應(yīng)在30分鐘以內(nèi)，吸收度與反應(yīng)時間有良好的線性關(guān)系，測定系統(tǒng)選用15分鐘。 酶量在50g之內(nèi)，吸收度與酶濃度具有線性關(guān)系。,41,測定條件,1%染色菌體緩沖液1ml 37水浴保溫約5分鐘 加酶試樣0.5ml準確反應(yīng)15分鐘 加入酸/乳

15、化劑混合液2ml，終止反應(yīng)，反應(yīng)液經(jīng)離心，上清液于540nm比色，所得吸收度從酶濃度標準曲線即可查出試樣中溶菌酶含量。,42,二、正交設(shè)計多因素選擇,正交試驗設(shè)計（Orthogonal experimental design）是一種高效的利用正交表來安排多因素多水平設(shè)計試驗的方法。 通過巧妙的安排和分組，用較少的試驗次數(shù)，就能分析各因素的作用大小，找出最佳的試驗條件。 利用各因素所對應(yīng)指標的極差R及平均極差D作出判斷。,43,正交試驗優(yōu)選中性蛋白酶活力測定條件,中性蛋白酶是一種蛋白水解酶，活力測定以酪蛋白為底物，水解產(chǎn)物與福林試劑在堿性情況下反應(yīng)生成有色物質(zhì)，于680nm處測定吸收值。 中性蛋

16、白酶作用受緩沖液的pH值、底物濃度、反應(yīng)時間及酶濃度等因素的影響。 供試品：0.01%的中性蛋白酶溶液。 底物：酪蛋白,44,實驗方案,實驗取四個因素： PH值、底物濃度、反應(yīng)時間、酶濃度。 每個因素選三水平，屬于多因素多水平，為此選用L9（34）正交表進行實驗。,45,46,正交試驗表,47,正交實驗安排表,48,正交實驗安排表,49,各因素試驗值計算結(jié)果,平均極差越大，對應(yīng)的因素影響越大。 緩沖液PH值7.2，底物濃度0.5%，酶濃度用100U/ml為最佳反應(yīng)條件。 反應(yīng)時間為10，20，30min，對OD值無顯著影響。,50,各因素試驗值的方差分析,結(jié)論： PH值（A）、底物濃度（B）、

17、酶濃度（D）為非常顯著因子； 反應(yīng)時間（C）為非顯著因子。,51,第五節(jié) 酶類藥物的檢測,肽鍵水解酶 脂鍵水解酶 糖苷鍵水解酶 其它（超氧化物歧化酶）,52,一、肽鍵水解酶,1、胰蛋白酶 2、彈性蛋白酶 3、尿激酶,53,54,1、胰蛋白酶（Trypsin）,胰蛋白酶（Trypsin） ：由動物胰臟中提取的一種蛋白水解酶。 牛胰蛋白酶：223個氨基酸，分子量24000，等電點10.1。 豬胰蛋白酶：214個氨基酸，分子量23400，等電點10.8。 胰蛋白酶最適pH為7.68.0，電泳純的胰蛋白酶的比活為8000單位/mg。,55,胰蛋白酶,56,胰蛋白酶,57,原理,胰蛋白酶專一作用于賴氨酸

18、、精氨酸等堿性氨基酸的羧基組成的肽鍵、酰胺鍵及酯鍵，水解速度為酯鍵酰胺鍵肽鍵。 BAEE(Benzoyl-L-Arginine-Ethyl-Ester) BAA(Benzoyl-L-Arginine-Anide) 苯甲酰L精氨酸乙酯（BAEE）在胰蛋白酶的作用下，酯鍵被水解生成苯甲酰L精氨酸，在253nm波長處的吸收度隨酶促反應(yīng)遞增，因此連續(xù)記錄不同時間的產(chǎn)物生產(chǎn)量，根據(jù)活力單位定義計算酶活力。,58,測定法：,取呈直線的吸收度，按下式計算： P為每mg供試品含胰蛋白酶的單位，U；A1為直線上終止的吸收度； A2為直線上開始的吸收度； T為A1至A2讀數(shù)的時間，min； W為測定液中供試品的量

19、，mg； 吸收度每分鐘改變0.003，即相當于1個胰蛋白酶單位 。,下文為中國藥典2015版胰蛋白酶活力測定方法，請仔細閱讀，并闡述此酶活力測定的原理？其酶活力測定方法屬于哪一種？胰蛋白酶作用位點有哪些？寫出測定所用底物的英文縮寫？,供試品的制備：精密稱取本品適量，用鹽酸（0.001mol/L）制成每1ml中含5060胰蛋白酶單位的溶液。 底物溶液的制備：取N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯鹽酸鹽85.7mg，加水溶解使成100ml，作為底物原液；底物溶液應(yīng)在制成后2小時內(nèi)使用。 測定法：取底物溶液3.0ml，加鹽酸溶液（0.001ml/L）0.2ml，混勻，作為空白，取供試品溶液0.2ml加底物溶液

20、（預(yù)熱至250.5）3.0ml，立即計時并搖勻，使比色池內(nèi)溫度保持在250.5，照紫外可見分光光度法在253nm的波長處，每隔30秒種讀取吸收度，共5分鐘。每30秒鐘吸收度的變化率應(yīng)恒定在0.0150.018之間，呈線性關(guān)系的時間不得少于3分鐘。若不符合上述要求，應(yīng)調(diào)整供試品的溶液濃度，另行測定。以吸收度為縱坐標，時間為橫坐標做圖，取在3分鐘內(nèi)成直線部分的吸收度，按下式計算。 式中 P為每1mg供試樣品中胰蛋白酶的單位數(shù)； A1為直線上終止的吸收度；A2為直線上開始的吸收度； T為A1至A2讀數(shù)的時間（分）；W為測定液中供試品的量； 0.003為上述條件下，吸收度每分鐘改變0.003相當于一個

21、胰蛋白酶單位。,60,2、胰彈性蛋白酶（Elastase）,肽鍵水解酶，存在于哺乳動物胰臟。 胰彈性蛋白酶是由240個氨基酸組成的單一肽鏈，有四對二硫鍵。分子量為25900，等電點為9.5。 胰彈性蛋白酶除水解彈性蛋白外，還可以水解血紅蛋白、酪蛋白等蛋白。 剛果紅彈性蛋白。,61,胰彈性蛋白酶測定原理,剛果紅彈性蛋白法：以剛果紅彈性蛋白為底物，由于剛果紅彈性蛋白結(jié)合的共價鍵能被彈性酶水解，根據(jù)剛果紅在495nm處有最大吸收，由標準曲線即可查得彈性酶單位數(shù)。 單位：20分鐘水解1mg剛果紅彈性蛋白所需的酶量為一個彈性酶活力單位。,62,方法:,63,3、尿激酶（Urokinase）,由人尿制得的

22、一種堿性蛋白水解酶。 主要作用是激活人體內(nèi)纖維蛋白溶酶原使其成為有活性的纖維蛋白溶酶，從而解聚血纖維蛋白，溶解血栓。 天然尿激酶的分子量為54000，其作用于纖維蛋白溶解酶原的賴氨酸或精氨酸鍵使其裂解成纖維蛋白溶解酶。,64,效價測定原理(氣泡上升法),尿激酶激活人體內(nèi)纖維蛋白溶酶原使其轉(zhuǎn)化成纖維蛋白溶酶； 纖維蛋白原在凝血酶的作用下，轉(zhuǎn)變成纖維蛋白凝塊，此凝塊在纖維蛋白溶酶作用下，水解為可溶性小分子多肽。 在纖維蛋白溶酶原過量的情況下，尿激酶量與纖維蛋白凝塊的溶解時間的對數(shù)成直線關(guān)系。,65,操作(氣泡上升法),試管中加纖維蛋白原溶液0.3ml（37水?。?標準品(或供試品) 1.0ml 加

23、混合溶液0.4ml 立即搖勻計時，反應(yīng)系統(tǒng)應(yīng)在3045秒內(nèi)凝結(jié)，當凝塊內(nèi)小氣泡上升到系統(tǒng)體積一半時作為反應(yīng)終點。 以尿激酶的濃度為橫坐標，以反應(yīng)時間的對數(shù)為縱坐標。,66,二、脂鍵水解酶 胰脂肪酶(Pancreatic Lipase ),胰脂肪酶是一種水解酶，在一定條件下把甘油三脂類脂肪水解，最后生成甘油及脂肪酸。 底物:橄欖油 用已知濃度的標準堿溶液滴定，可定量地測定脂肪酸的量，從而得知脂肪酶活力。,67,測定,68,計算,每分鐘水解橄欖油產(chǎn)生1mol脂肪酸的酶量，為1個活力單位。 每克含有的胰脂肪酶單位 A:供試品消耗NaOH （0.1mol/L）的體積 B:空白消耗NaOH （0.1mo

24、l/L）的體積 W:供試品取樣量（g） N:供試品稀釋倍數(shù)。,69,三、糖苷鍵水解酶 溶菌酶,蛋清中提取的能分解粘多糖的堿性水解酶。 溶菌酶（Lysozyme）具有抗菌、抗病毒等作用。 溶菌酶分子量為1400015000，由129個氨基酸殘基組成，等電點為10.011.1。 溶菌酶屬糖苷鍵水解酶，能以某些細菌細胞中的多糖為底物。,70,溶菌酶作用位點,71,青霉素,轉(zhuǎn)肽酶底物末端的二肽D-Ala-D-Ala結(jié)構(gòu),72,效價測定比濁法,以溶酶小球菌為底物，主要成分為粘多糖，粘多糖由NAG和NAM重復(fù)而成。 只能水解NAM C1 和NAG C4之間的1，4糖苷鍵。 溶酶小球菌胞壁中的粘多糖經(jīng)過溶菌

25、酶的水解后，導(dǎo)致溶菌，溶液的吸收度下降。 在一定的條件下，每分鐘吸收度下降0.001為一個酶活力單位。,73,比濁法測定,計算： 酶活力單位（u/mg） = W為測試液中供試品的重量（g）,74,比色法-測定溶菌酶活性,用染料艷紅K2BP標記的M.Lysodeikticus為底物，酶催化細胞壁分解時游離出染色碎片（產(chǎn)物） 反應(yīng)后離心除去未分解底物，上清液比色，吸收度為溶菌酶活力的函數(shù)。,75,溶菌酶效價測定比色法,76,四、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase）,由動物紅細胞制得的金屬酶，能催化超氧陰離子轉(zhuǎn)化成過氧化氫和氧。 來源于牛、豬、人紅血球的超氧化物歧化酶（SOD）

26、含銅和鋅，分子量32000左右。 SOD對熱較穩(wěn)定，在pH5.39.5范圍內(nèi)對酶活性影響不大。 牛紅細胞SOD PI為4.95。,77,效價測定,SOD測定方法： 間接法：使用氧自由基指示清除劑， SOD與指示清除劑競爭O2- ，從而抑制指示清除劑與O2- 的結(jié)合，根據(jù)指示清除劑與O2- 反應(yīng)速度的變化可間接測定SOD的活性。 間接法包括：黃嘌呤氧化酶細胞色素C法和鄰苯三酚法。,78,黃嘌呤氧化酶細胞色素C法,原理：在有氧條件下，黃嘌呤氧化酶能催化黃嘌呤成尿酸，與此同時產(chǎn)生O2- ，氧化型細胞色素C被O2- 還原為還原型細胞色素C，后者在550nm有最大吸收，因此測定氧化性細胞色素C在加入SO

27、D前后的光吸收變化可間接計算酶活性。,79,方法,80,注意點,在特定條件下，25 （pH7.8）每分鐘抑制細胞色素C還原速率達50所需要的酶量為一個活力單位。 注意事項： 重金屬離子易使黃嘌呤氧化酶失活，因此反應(yīng)體系中必須添加EDTA。 反應(yīng)體系中含過氧化氫酶可引起還原型細胞色素C發(fā)生過氧化作用，從而干擾檢測的正確。,81,鄰苯三酚法,原理：在堿性條件下，鄰苯三酚會發(fā)生自氧化生成紅 酚，同時生成O2- ，當有SOD 存在時由于它能催化O2- 與H+結(jié)合生成O2和H2O2，從而阻止了中間產(chǎn)物的積累。 定義:在一定條件下，每分鐘抑制鄰苯三酚自氧化速率達50的酶量為一個酶活力單位。,82,操作,定

28、義:在一定條件下，每分鐘抑制鄰苯三酚自氧化速率達50的酶量為一個酶活力單位。,83,門冬酰胺酶（L-Asparaginase）,本品系自大腸桿菌（Ecoli ASI.357）中提取制備的具有酰氨基水解作用的酶。 每毫克蛋白含門冬酰胺酶效價不得低于250U?？鼓[瘤酶類藥物(腫瘤細胞缺乏L-門冬酰胺合成酶)。 治療小兒急性淋巴細胞性白血病和淋巴肉瘤。,84,測定,在上述規(guī)定條件下，每分鐘催化L-門冬酰胺水解釋放1g分子氨所需的酶量定義為1個酶活力單位 比活力測定方法：采用Lowry法測定蛋白質(zhì)含量，比活力=酶活力(U)/蛋白含量(mg)。,85,天冬氨酸酶活力的測定,，一個酶活力單位定義為在測定條

29、件下，每小時每克細胞轉(zhuǎn)化生成1mol天冬氨酸所需的酶量.,86,實例：尿激酶（urokinase）,本品系從新鮮人尿中提取的一種激活纖維蛋白溶酶原的酶。 由高分子量54000和低分子量33000組成的混合物，高分子量含量不得少于90%，每1mg蛋白中尿激酶活力不得少于12萬U，蛋白分解藥物。,87,尿激酶,（一）性狀 本品為白色非結(jié)晶狀粉末 （二）鑒別 取比活力測定項下的供試品溶液，用巴比妥-氯化鈉緩沖液（pH7.8）稀釋成每1ml中含20U的溶液，吸取1ml，加纖維蛋白原溶液0.3ml，再依次加入纖維蛋白溶酶原溶液0.2ml，凝血酶溶液0.2ml，迅速搖勻，立即置370.5恒溫水浴中保溫，記

30、時，反應(yīng)系統(tǒng)應(yīng)在3045s內(nèi)凝結(jié)，且凝塊在15min內(nèi)重新溶解。以0.9%氯化鈉溶液作空白，同法操作，凝塊在2h內(nèi)不溶。,88,（三）檢查,1溶液的澄清度與顏色， 應(yīng)澄清無色。 2分子組分比 取本品，加水制成每1ml中含2mg的溶液后，加入等體積的緩沖液，置水浴中3min，放冷，作為供試品溶液；取供試品溶液10l，加至樣品孔，照電泳法測定，按下式計算高分子尿激酶相對含量（%）。,89,（三）檢查,3干燥失重 取本品，以五氧化二磷為干燥劑，在60減壓干燥至恒重，減失重量不得過5.0%。 4異常毒性取本品，加氯化鈉注射液制成每1ml中含5000U的溶液，依法檢查，按靜脈注射法給藥，應(yīng)符合規(guī)定。 5熱原 取本品，加氯化鈉注射液制成每1ml中含20000U的溶液，依法檢測，按家兔體重每1kg注