免疫細胞功能檢測技術

1、免疫細胞功能檢測技術,一 淋巴細胞的功能檢測,淋巴細胞功能測定可分為體內實驗和體外實驗。體內實驗主要是間接了解淋巴細胞對抗原、半抗原或有絲分裂原的應答反應；體外實驗主要包括淋巴細胞對抗原或有絲分裂原刺激后的增殖反應、細胞毒性試驗及淋巴細胞分泌產(chǎn)物的測定,淋巴細胞,T細胞（負責細胞免疫功能） B細胞（執(zhí)行體液免疫功能） NK細胞（非特異性免疫作用）,一、T細胞功能的檢測,T細胞增殖試驗 T細胞分泌功能測定 T細胞介導的細胞毒試驗 體內試驗,（一）T淋巴細胞增殖試驗,1. 原理：,淋巴細胞,DNA合成,分化,母細胞,刺激物,細胞變大,細胞漿擴大,空泡,核仁明顯,核染色質疏松,2. 淋巴細胞轉化的刺

2、激物,非特異性刺激物： PHA -T細胞 ConA -T細胞 PWM -T、 B細胞 LPS -B細胞 特異性刺激物： 異種抗原 同種組織抗原,3. 檢測方法,形態(tài)法：刺激物 淋巴細胞（4-6天） 母細胞化 同位素法：PHA 淋巴細胞（54h） DNA合成期 + 3HTdR摻入 收集細胞 檢測射線,測定細胞內的3HTdR,（1）形態(tài)學檢查法,方法學評價：,優(yōu)點：形態(tài)學方法簡便易行，普通光學顯微鏡便能觀察結果，適于基層實驗室應用。 缺點：是依靠肉眼觀察形態(tài)學變化，判斷結果易受主觀因素影響，重復性和準確性較差。,（2）3H-TdR摻入法,優(yōu)點：3H-TdR摻入法敏感性高，客觀性強，重復性好。 缺點

3、：但需一定設備條件，同時還存在放射性核素污染問題。,MTT,測吸光度,(3) MTT 比色法,(二) T細胞分泌功能測定,體外培養(yǎng)的T細胞經(jīng)各種絲裂原或抗原刺激后,分泌各種細胞因子,可借助免疫學、細胞生物學及分子生物學技術分別檢測細胞因子含量、生物學活性或基因表達水平，以反映T細胞功能。,（三）T細胞介導的細胞毒試驗,1.原理：,靶細胞抗原,T細胞,觀察殺傷活力,致敏CTL,靶細胞,形態(tài)學方法：淋巴細胞+腫瘤細胞 計數(shù)殘留腫瘤細胞,2.方法,意義： 腫瘤患者CTL殺傷腫瘤細胞的能力,51Cr釋放法,(四) 體內試驗,特異性抗原皮膚試驗 PHA皮膚試驗,二、B細胞功能檢測,B細胞增殖能力的試驗

4、溶血空斑試驗 B細胞抗體形成功能的檢測 體內試驗,(一)B細胞增殖能力的試驗,抗IgM 細菌脂多糖 SAC的SPA,B細胞增殖,形態(tài)學,3HTdR摻入法,(二) 溶血空斑試驗,1. 原理：,2. 方法學：,經(jīng)典溶血空斑形成試驗 被動溶血空斑試驗,3臨床應用與評價,溶血空斑試驗主要用于測定藥物和手術等因素對體液免疫功能的影響 評價免疫治療或免疫重建后機體產(chǎn)生抗體的能力。,(三) B細胞抗體形成功能的檢測 酶聯(lián)免疫斑點法ELISPOT,1.原理：,2應用與方法學評價：,該方法既可檢測抗體分泌細胞，又可檢測抗體分泌量。 優(yōu)點： 穩(wěn)定、特異、抗原用量少； 可同時檢測不同抗原誘導的不同抗體分泌，并可定量

5、；可檢測組織切片中分泌抗體的單個細胞。,(四)體內試驗,體內抗體產(chǎn)生的特異性抗原有白喉類毒素、破傷風類毒素、多價肺炎鏈球菌菌苗等。 將適量抗原皮下或肌肉注射免疫，并于免疫前及免疫后1周、2周、3周分別采血，分離血清，測定受檢者免疫前后相應抗體的效價，判斷受檢者體內B細胞的功能。,染色計數(shù),離心取上清 測LDH或AKP,離心取沉淀 測活細胞熒光,測發(fā)光強度,測CPM值,形態(tài)法 酶釋法 熒光法 同位素法 化學發(fā)光法,三、NK細胞活性測定,靶細胞溶解,常用靶細胞: K562細胞株,二 吞噬細胞功能檢測技術,按其形態(tài)大小分為兩類： 大吞噬細胞單核-吞噬細胞系統(tǒng) 小吞噬細胞中性粒細胞,一、中性粒細胞功能

6、的檢測,細胞趨化功能的檢測 吞噬和殺菌功能的檢測,(一) 細胞運動功能趨化功能檢測,1.原理：,2. 方法：,瓊脂糖平板法,濾膜滲透法（Boyden 小室法）,(二)吞噬和殺菌功能測定,1顯微鏡檢查法：,2. 溶菌法,NBT還原試驗,原理：,N-N- C + H+ N=N-R-,N-NH2 C N=NH,四氮唑基（淡黃色）,甲臜（紫黑色）,3NBT還原試驗,中性粒細胞,NBT,甲臜顆粒沉積于胞質中,二、巨噬細胞功能檢測,(一)炭粒廓清試驗,正常小鼠肝中枯否細胞可吞噬清除90%炭粒，脾巨噬細胞約吞噬清除10%炭粒。據(jù)此給小鼠定量靜脈注射印度墨汁(炭粒懸液)，間隔一定時間反復取靜脈血，測定血中炭粒的濃度，根據(jù)血流中炭粒被廓清的速度，判斷巨噬細胞的功能。,(二)吞噬功能檢測,巨噬細胞對顆粒性抗原物質具有很強的吞噬功能，常用雞紅細胞(CRBC)、白色念珠菌、酵母細胞等作為吞噬顆粒，用斑蟊敷貼法收集人巨噬細胞或從腹腔滲出液獲得鼠巨噬細胞。,(三)巨噬細胞溶酶體酶的測定,1酸性磷酸酶的測定 硝酸鉛法 偶氮法 2非特異性酯酶的測定 常用-萘醋酸法,(四) 細胞毒作用測定,用IFN-激活小鼠巨噬細胞，觀察其對125I-UdR標記的DBA/2小鼠肥大細胞瘤P815的殺傷活性。,(五) 巨噬細胞促凝