多重PCR 檢測(cè)金黃色葡萄球菌六型腸毒素基因的研究.doc

多重PCR檢測(cè)金黃色葡萄球菌六型腸毒素基因的研究劉繼超，姜鐵民，姜阿赤，陳歷俊*（北京三元食品股份有限公司，北京100076）摘要：目的：為了建立一種簡(jiǎn)單、快速檢測(cè)金黃色葡萄球菌六型腸毒素基因的多重PCR方法。方法：根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)和Genebank報(bào)道的編碼金黃色葡萄球菌腸毒素A、B、C、D、E、H的基因序列，選擇合成了6對(duì)特異性引物，建立多重PCR體系，并對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果：6對(duì)引物能同時(shí)特異地?cái)U(kuò)增出120bp、478bp、257bp、319bp、170bp和375bp的目的片段，表明6對(duì)引物具有良好的特異性。結(jié)論：本研究成功地建立了一種同時(shí)檢測(cè)金黃色葡萄球菌六型腸毒素基因的多重PCR方法，在金黃色葡萄球菌腸毒素快速篩查方面具有良好的應(yīng)用前景。關(guān)鍵詞：多重PCR；檢測(cè)；金黃色葡萄球菌；腸毒素AstudyonfastdetectionofsixkindsofStaphylococcusaureusenterotoxinsgeneswithamultiplexPCRmethodLIUJi-chao,JIANGTie-min,JIANGA-chi,CHENLi-jun*(BeijingSanyuanFoodsCo.Ltd.,Beijing,100076)Abstract:Objective:ToestablishamultiplexPCRmethodfordetectingSEA,SEB,SEC,SED,SEEandSEHgenesofStaphylococcusaureusfastandhighlyeffectively.Methods:AccordingtoSEA,SEB,SEC,SED,SEEandSEHgenesequencesofStaphylococcusaureusinGenBankandrelevantliteratures,sixpairsofspecificprimershadbeendesigned.EstablishedmultiplexPCRmethodsanditsreactionconditionswereoptimized.Results:Undertheoptimizedconditions,thesixfragmentsof120bp,478bp,257bp,319bp,170bpand375bpweresimultaneouslyamplifiedfromsixcoupleprimers.TheresultsshowedthatthePCRofsixpairsprimersweregoodspecifity.Conclusions:Asimple,rapidandsensitivemultiplexPCRmethodfordetectingsixkindsofS.aureusenterotoxingeneshasbeenestablished.ItcoulddetectSEA,SEB,SEC,SED,SEEandSEHgenessimultaneously,therefore,theprospectoffastdetectionofStaphylococcusaureusenterotoxinisbrilliant.Keywords:multiplexPCR,detection,Staphylococcusaureus,enterotoxin金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，SA)，是國(guó)內(nèi)外最常見的細(xì)菌性食物中毒病原體之一，該菌引起食物中毒的主要原因是產(chǎn)生葡萄球菌腸毒素(staphylococcalenterotoxins，SEs)。根據(jù)其血清學(xué)特性，SEs可分為5型(SEA、SEB、SEC、SED、SEE)，近幾年還報(bào)道了SEG、SEH、SEI、SKJ、SEK、SEL、SEM、SEN和SEO、SEP、SEQ、SER、SET、SEU等新分型的腸毒素1-4。目前國(guó)內(nèi)外通訊作者：陳歷俊，基金項(xiàng)目：“十一五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃(2009BADB9B06)；北京市重點(diǎn)科技計(jì)劃項(xiàng)目(D1011050460000)作者簡(jiǎn)介：劉繼超，男，1983年出生，碩士，乳品微生物。用于檢測(cè)SEs的方法按照檢測(cè)原理的不同，可分為生物學(xué)檢測(cè)方法、免疫血清學(xué)方法、聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)、生物傳感器技術(shù)及超抗原技術(shù)等5-6。這些方法都存在一個(gè)問題：即一次實(shí)驗(yàn)只能檢測(cè)一種病原菌。如采用多重PCR檢測(cè)，則既具有PCR簡(jiǎn)便快速的特點(diǎn)，又能在同一反應(yīng)體系中同時(shí)檢測(cè)多種SEs。本研究針對(duì)金黃色葡萄球菌腸毒素的6種血清型(A、B、C、D、E、H型)設(shè)計(jì)選擇特異性PCR引物，進(jìn)行多重PCR檢測(cè)，建立一種快速一次性檢測(cè)6種腸毒素血清型的多重PCR檢測(cè)方法。1材料與方法1.1材料1.1.1菌種標(biāo)準(zhǔn)菌株(見表1)分別購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所菌種保藏中心、中國(guó)微生物菌種保藏中心、中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所和美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)(ATCC)。表1試驗(yàn)用標(biāo)準(zhǔn)菌株Table1Teststandardstrains菌名菌種編號(hào)金黃色葡萄球菌腸毒素AATCC-13565金黃色葡萄球菌腸毒素BATCC-14458金黃色葡萄球菌腸毒素CATCC-19095金黃色葡萄球菌腸毒素DATCC-23235金黃色葡萄球菌腸毒素EATCC-27664金黃色葡萄球菌腸毒素HATCC-51811單增李斯特菌ATCC-15313大腸桿菌ATCC-25922金黃色葡萄球菌CGMCC-1.0128沙門氏菌CGMCC-1.1552表皮葡萄球菌CGMCC-1.24291.1.2試劑溶菌酶、RNaseA、EDTA、SDS、NaCl、無水乙醇、苯酚、氯仿、異戊醇等均為國(guó)產(chǎn)分析純；瓊脂糖(SpainAgarose香港基因公司分裝)；TaqDNA聚合酶、dNTPs購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；PCR染料、DNAMarkerB購(gòu)自北京賽百盛基因技術(shù)公司。1.1.3儀器GeneAmpPCRSystem2400PCR儀(美國(guó)PE公司)，PAC300電泳儀(BIO-RAD公司)，TanonGIS2010凝膠成像儀(上海天能科技有限公司)，離心機(jī)2K15(Sigma)，ThermopH計(jì)(美國(guó))，LRH-250生化培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)。1.2方法1.2.1模板DNA的提取在無菌條件下，用滅菌處理的接種環(huán)分別挑取試驗(yàn)用標(biāo)準(zhǔn)菌落，接種于5ml營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37培養(yǎng)過夜后培養(yǎng)基出現(xiàn)明顯混濁，即培養(yǎng)基中有大量菌體增殖。使用培養(yǎng)好的菌液進(jìn)行金黃色葡萄球菌基因組DNA的提取，提取菌體DNA方法見參考文獻(xiàn)7-8。1.2.2擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)參考有關(guān)文獻(xiàn)9-14設(shè)計(jì)選擇SEA、SEB、SEC、SED、SEE、SHE的PCR引物，引物的序列及目的產(chǎn)物長(zhǎng)度見表2。表2多重PCR引物的序列及目的產(chǎn)物長(zhǎng)度Table2BasesequencesofthemultiplexPCRspecificoligonucleotideprimersandpredictedsizesofamplifiedproducts基因引物引物序列長(zhǎng)度(bp)產(chǎn)物長(zhǎng)度（bp）seaSEA-FTTGGAAACGGTTAAAACGAA20120SEA-RGAACCTTCCCATCAAAAACA20sebSEB-FTCACATCAAACTGACAAACG20478SEB-RGCAGGTACTCTATAAGTGCC20secSEC-FGACATAAAAGCTAGGAATTT20257SEC-RAAATCGGATTAACATTATCC20sedSED-FCTAGTTTGGTAATATCTCCTTTAAACG27319SED-RTTAATGCTATATCTTATAGGGTAAACATC29seeSEE-FTAGATAAAGTTAAAACAAGC20170SEE-RTAACTTACCGTGGACCCTTC20sehSEH-FCATTCACATCATATGCGAAAGCAG24375SEH-RCATCTACCCAAACATTAGCACC221.2.3多重PCR體系的建立利用從標(biāo)準(zhǔn)菌株中所提取的基因組DNA作為模板，通過每對(duì)引物單獨(dú)擴(kuò)增其目的基因的常規(guī)PCR，盡量找出共同條件，統(tǒng)一條件后進(jìn)行混合引物擴(kuò)增多個(gè)模板的多重PCR，并摸索最佳反應(yīng)條件。多重PCR反應(yīng)體系為：模板DNA：6l(六種菌株DNA各1l)；25mol/l上下游引物：6l(六對(duì)引物各1l)；2.5mol/ldNTPs：3l；5U/lTaq酶：1.5l(5U/l)；10PCRBuffer：5l；PCR染料：5l，用無菌超純水補(bǔ)充至總體積50l。離心混勻后置PCR儀上進(jìn)行自動(dòng)化擴(kuò)增反應(yīng)，循環(huán)參數(shù)為94預(yù)變性4min；94變性1min；50退火45s；72延伸1min；共35個(gè)循環(huán)；最后72延伸10min，4保存。1.2.4特異性試驗(yàn)分別用每對(duì)引物擴(kuò)增其目的菌株及表1中其它所有菌株，觀察各對(duì)引物的特異性。同時(shí)應(yīng)用6對(duì)引物擴(kuò)增表1中的所有菌株，觀察多重PCR條件下引物的特異性并摸索最佳反應(yīng)條件，然后對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)。2結(jié)果與分析2.1多重PCR特異性分析以提取的6種目標(biāo)菌株DNA為模板，另外分別以沙門氏菌、無乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌提取的單一DNA為模板，同時(shí)加入6對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增(見圖1)。結(jié)果表明，對(duì)照組金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌、沙門氏菌、大腸桿菌、表皮葡萄球菌及陰性對(duì)照均沒有擴(kuò)增現(xiàn)象，擴(kuò)增結(jié)果見圖1。表明6對(duì)多重PCR引物對(duì)于擴(kuò)增金黃色葡萄球菌腸毒素的6種血清型(A、B、C、D、E、H)具有較好的特異性。圖1多重PCR特異性分析Fig1SpecificityofmultiplexPCRanalysisM：DNAMarkerB；1：多重PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物；2：SEA的擴(kuò)增產(chǎn)物120bp；3：SEB的擴(kuò)增產(chǎn)物478bp；4：SEC的擴(kuò)增產(chǎn)物257bp；5：SED的擴(kuò)增產(chǎn)物319bp；6：SEE的擴(kuò)增產(chǎn)物170bp；7：SEH的擴(kuò)增產(chǎn)物375bp；8：金黃色葡萄球菌；9：表皮葡萄球菌；10：?jiǎn)卧隼钏固鼐?1：大腸桿菌；12：沙門氏菌；13：陰性對(duì)照2.2多重PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化PCR反應(yīng)的影響因素很多，其中1個(gè)重要參數(shù)就是退火溫度，其次還有Mg2+濃度、循環(huán)數(shù)等。首先利用PCR儀優(yōu)化退火溫度，在最佳的退火溫度下再根據(jù)條帶的亮暗調(diào)整Mg2+濃度，同時(shí)調(diào)整循環(huán)數(shù)，以便在最短的時(shí)間內(nèi)達(dá)到最佳的效果。2.2.1退火溫度的優(yōu)化設(shè)置退火溫度梯度：46、47、48、49、50，使用3.0%的瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果見圖2。多重PCR的六條目的帶在退火溫度為48間時(shí)亮度最佳，故多重PCR的最佳退火溫度為48。圖2多重PCR退火溫度梯度結(jié)果Fig2TheresultsofmultiplexPCRannealingtemperaturegradientM：DNAMarkerB；1：退火溫度為46；2：退火溫度為47；3：退火溫度為48；4：退火溫度為49；5：退火溫度為502.2.2Mg2+濃度的優(yōu)化設(shè)置Mg2+濃度梯度為1.5mM、2.0mM、2.5mM、3.0mM，電泳結(jié)果見圖3。Mg2+濃度為2.0mM時(shí)多重PCR的目的帶較好，故選Mg2+的最佳濃度為2.0mM。圖3Mg2+濃度梯度結(jié)果Fig3TheresultsofMg2+concentrationgradient1：Mg2+濃度為1.5mM；2：Mg2+濃度為2.0mM；3：Mg2+濃度為2.5mM；4：Mg2+濃度為3.0mM；M：DNAMarkerB；2.2.3循環(huán)數(shù)的優(yōu)化設(shè)置循環(huán)數(shù)梯度為32、35、38，電泳結(jié)果見圖4，可知循環(huán)數(shù)為35時(shí)的目的帶最好，故最佳循環(huán)數(shù)為35。圖4循環(huán)數(shù)梯度結(jié)果Fig4Theresultsofcyclesgradient1：循環(huán)數(shù)為32；2：循環(huán)數(shù)為35；3：循環(huán)數(shù)為38；M：DNAMarkerB3結(jié)論根據(jù)genebank報(bào)道的編碼金黃色葡萄球菌腸毒素A、B、C、D、E、H的基因序列，設(shè)計(jì)了6對(duì)PCR引物，目的片段的長(zhǎng)度分別為120bp、478bp、257bp、319bp、170bp和375bp。多重PCR擴(kuò)增結(jié)果表明6對(duì)PCR引物具有良好的特異性，并多重PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化，優(yōu)化結(jié)果為最佳退火溫度48、Mg2+的最佳濃度2.0mM、最佳循環(huán)數(shù)35。本研究成功地建立了簡(jiǎn)單、快速的多重PCR方法，可以一次性檢測(cè)金黃色葡萄球菌六型腸毒素基因，在金黃色葡萄球菌腸毒素快速篩查方面具有良好的應(yīng)用前景。參考文獻(xiàn)1ZschockM,KloppertB,WolterW,etal.Patternofenterotoxingenesseg,seh,seiandsejpositiveStaphylococcusaureusisolatedfrombovinemastitisJ.VetMicrobiol,2005,108:243249.2LovsethA,LoncarevicS,BerdalKG.ModifiedmultiplexPCRmethodfordetectionofpyrogenicexotoxingenesinstaphylococcalisolatesJ.JClinMicrobiol,2004,42:38693872.3OmoeK,IshikawaM,ShimodaY,etal.Detectionofseg,seh,andseigenesinStaphylococcusaureusisolatesanddeterminationoftheenterotoxinproductivitiesofS.aureusisolatesHarboringseg,seh,orseigenesJ.JClinMicrobiol,2002,40(3):857-862.4RosecJP,GigaudO.StaphylococcalenterotoxingenesofclassicalandnewtypesdetectedbyPCRinFranceJ.IntJFoodMicrobiol,2002,77(1-2):61-70.5李紅云，施志國(guó)，姚詠明.金黃色葡萄球菌腸毒素和中毒性休克毒素檢測(cè)的研究進(jìn)展J.國(guó)外醫(yī)學(xué)臨床生物化學(xué)與檢驗(yàn)學(xué)分冊(cè)，2000，21(5)：247251.6向陽.食品中金黃色葡萄球菌及其腸毒素的檢測(cè)方法J.中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2002，2(2)：57-61.7J.S.Moon,A.R.Lee,H.M.Kang,etal.AntibiogramandCoagulaseDiversityinStaphylococcalEnterotoxin-ProducingStaphylococcusaureusfromBovineMastitisJ.JournalofDairyScience,2007,90(4):1716-1724.8SudhirTamarapu,JohnLMc,etal.DevelopmentofaMultiplexPolymeraseChainReactionAssayforDetectionandDifferentiationofStaphylococcusaureusinDairyProductsJ.JFoodProt,2001,64(5):664-668.9W.M.Johnson,S.D.Tyler,E.P.Ewan,etal.DetectionofGenesforEnterotoxins,ExfoliativeToxins,andToxicShockSyndromeToxin1inStaphylococcusaureusbythePolymeraseChainReactionJ.JournalofClinicalMicrobiology,1991,29(3):426430.10SophieJarraud,GregoireCozon,FrancoisVandenesch,etal.InvolvementofEnterotoxinsGandIinStaphylococcalToxicShockSyndromeandStaphylococcalScarletFeverJ.JournalofClinicalMicrobiology,1999,37(8):24462449.11ManishaMehrotra,GehuaWang,WendYM.Johnson.MultiplexPCRforDetectionofGenesforStaphylococcusaureusEnterotoxins