色譜-毛細(xì)管電泳法

1,第三章 毛細(xì)管電泳法,姚彤煒,2,概述,毛細(xì)管電泳又叫高效毛細(xì)管電泳 (HPCE)，是80年代初發(fā)展起來的一種新型分離分析技術(shù)，它是電泳技術(shù)與層析技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物廣泛用于生物大分子，手性藥物，生物體內(nèi)的藥物及代謝物，中西藥物及其制劑等的分析，在選擇性上與高效液相法有很大的互補(bǔ)性被多國(guó)藥典收載，如2010年版中國(guó)藥典對(duì)鹽酸頭孢吡肟中N-甲基吡咯烷的檢查，USP對(duì)鹽酸羅哌卡因的對(duì)映體純度檢查，均采用毛細(xì)管電泳法測(cè)定,3,一、基本原理,高效毛細(xì)管電泳以高壓電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力，以毛細(xì)管為分離通道，依據(jù)各組分之間的遷移速度和分配行為上的差異而實(shí)現(xiàn)分離的一類技術(shù)在毛細(xì)管電泳中有兩個(gè)重要的遷移：電泳遷移電滲流遷移,4,電泳遷移,在電場(chǎng)作用下，帶電組分作定向移動(dòng)。其遷移速度（）可用下式表示： = eE （1）e為電泳淌度E為電場(chǎng)強(qiáng)度（V/L）是外加電壓和毛細(xì)管長(zhǎng)度的函數(shù),5,電泳遷移原理,對(duì)于給定的離子和介質(zhì)，淌度e為離子的特征常數(shù)，其大小取決于分子所受的電場(chǎng)力FE和其通過介質(zhì)時(shí)的摩擦力FF的平衡： FE = qE （q為離子電量） FF= 6r （ 溶液粘度, r 離子半徑, 離子速度）達(dá)到平衡時(shí)，兩種力大小相等而方向相反，即 qE =6r （2）,6,電泳遷移原理,根據(jù)式(1) =eE ，淌度e=/E 根據(jù)式(2) qE=6r，/E =q/(6r)所以 e= q/(6r ) （3）式（3）表明，帶電量大的物質(zhì)，離子半徑小的物質(zhì)有較高的淌度,7,淌度,淌度物理常數(shù)，是在溶質(zhì)帶最大電量時(shí)測(cè)定并外推至無(wú)限稀釋條件下的數(shù)值，即絕對(duì)淌度有效淌度實(shí)驗(yàn)條件下測(cè)得的數(shù)值，其取決于操作緩沖液的pH值和組成,8,溶液pH值對(duì)淌度的影響,若兩種溶質(zhì)在完全離子化狀態(tài)下，具有相同的電泳淌度，則因沒有差速遷移而不能分離但若它們具有不同的pKa值，則可調(diào)節(jié)溶液pH值，使他們具有不同的有效淌度，而達(dá)到分離的目的,9,電滲流（EOF）,毛細(xì)管電泳中的一個(gè)重要現(xiàn)象，是毛細(xì)管內(nèi)壁表面電荷所引起的管內(nèi)液體整體流動(dòng)的現(xiàn)象，是推動(dòng)流體前進(jìn)的驅(qū)動(dòng)力當(dāng)固體與液體接觸時(shí)，固-液兩相界面上會(huì)帶有相反符號(hào)的電荷，形成雙電層。對(duì)于石英毛細(xì)管柱，當(dāng)溶液pH值達(dá)4以上時(shí)，其內(nèi)壁帶負(fù)電荷，管中液體將感應(yīng)一層正電荷，形成雙電層，在高電壓作用下緩沖液整體向負(fù)極移動(dòng)，此即電滲流(eof),10,電滲流,在電場(chǎng)作用下,電滲流作用示意圖,11,電滲流性質(zhì),電滲流的一個(gè)獨(dú)特性質(zhì)是其具有平面流型，推動(dòng)液體流動(dòng)的力在毛細(xì)管內(nèi)均勻分布，平面流型的優(yōu)點(diǎn)是對(duì)譜帶的擴(kuò)散沒有直接作用,12,帶電微粒在毛細(xì)管內(nèi)的移動(dòng)的速度,帶電微粒在毛細(xì)管內(nèi)的移動(dòng)的速度為電泳流和電滲流的矢量和。 = (e + eof）V/L一般情況下，電滲流的方向是由正極向負(fù)極移動(dòng)，而電滲流的速度又遠(yuǎn)大于電泳流,故所有組分均向同一方向陰極移動(dòng)，但速度各不相同,13,淌度與遷移時(shí)間,式中L為毛細(xì)管總長(zhǎng)度， l為毛細(xì)管有效長(zhǎng)度（進(jìn)樣點(diǎn)到檢測(cè)器距離），V為電壓當(dāng)L， l， V一定時(shí)， Tm與e成反比,14,電滲流后的遷移時(shí)間,Tm=Ll/（ e + eof ）V（e + eof ）稱為表觀淌度a（即在電滲流存在下測(cè)得的淌度）溶質(zhì)從進(jìn)樣點(diǎn)遷移至檢測(cè)點(diǎn)所用的時(shí)間稱為“遷移時(shí)間(t)”，根據(jù)上式可計(jì)算溶質(zhì)的表觀淌度：a =e eof = Ll/tV當(dāng)L、l、V一定時(shí)， a與 t 成反比,15,二、分離度與理論板數(shù),分離度R = Z / 4 （Z為兩峰間距，為峰標(biāo)準(zhǔn)差）理想條件下理論板數(shù)n與電壓V的關(guān)系可表示為：N=（ e eof） Vl / 2DL（式中D為擴(kuò)散系數(shù)）D值小的大分子擴(kuò)散小，柱效高在高電場(chǎng)下(V值大)，溶質(zhì)在毛細(xì)管內(nèi)停留時(shí)間短，擴(kuò)散小， 柱效高,在實(shí)際工作中，按HPLC方法求得理論板數(shù)：N=5.54（t/w1/2）2,16,影響分離效率的因素,焦耳熱與溫度梯度電流通過而產(chǎn)生的熱稱為焦耳熱。受毛細(xì)管尺寸、溶液電導(dǎo)、外加電壓等影響不均勻的溫度梯度和局部的黏度變化會(huì)引起區(qū)帶展寬。溫度變化1黏度變化2%3% 淌度變化2%3% 進(jìn)樣塞長(zhǎng)度在進(jìn)樣過程中減少樣品塞長(zhǎng)度非常重要。對(duì)進(jìn)樣長(zhǎng)度的限制是低于毛細(xì)管總長(zhǎng)度的（12）%。例 70cm長(zhǎng)的毛細(xì)管，進(jìn)樣量應(yīng)小于7mm,17,影響分離效率的因素,溶質(zhì)與管壁相互作用可能導(dǎo)致峰拖尾或發(fā)生對(duì)溶質(zhì)的完全吸附。對(duì)多肽和蛋白質(zhì)來說，這種吸附特別嚴(yán)重?？刹捎枚喾N方法來減少相互作用：增加緩沖液濃度以降低有效表面電荷在極端pH值下進(jìn)行分離，使石英表面硅羥基以不帶電的形式存在對(duì)毛細(xì)管壁進(jìn)行涂層處理電分散作用樣品區(qū)帶與操作緩沖液的電導(dǎo)差異可產(chǎn)生峰型畸變,18, ,buffer,buffer,buffer,buffer,buffer,buffer,低電導(dǎo),等電導(dǎo),高電導(dǎo),樣品區(qū)帶,樣品區(qū)帶,樣品區(qū)帶,溶質(zhì)電導(dǎo)高于緩沖液，產(chǎn)生前沿峰,溶質(zhì)電導(dǎo)低于緩沖液，產(chǎn)生拖尾峰,樣品與緩沖液電導(dǎo)不匹配引起的電分散,19,三、分離模式,毛細(xì)管電泳的操作方式有多種，分離機(jī)制各不相同，常用的分離模式有：,20,毛細(xì)管區(qū)帶電泳（CZE）,CZE是應(yīng)用最廣泛的一種技術(shù)，在毛細(xì)管內(nèi)充滿緩沖液，不同質(zhì)荷比大小的組分在電場(chǎng)的作用下，根據(jù)遷移速度不同而達(dá)到分離緩沖液選擇因電滲流（EOF）對(duì)pH值很敏感，故要求采用緩沖液來維持恒定的pH值,21,對(duì)緩沖液的要求,強(qiáng)緩沖能力，低的紫外吸收，小的淌度。常用的緩沖液有Tris（三羥甲基氨基丙烷），硼酸鹽，磷酸鹽等緩沖液的pH值當(dāng)測(cè)定多肽、蛋白質(zhì)等時(shí)，由于溶質(zhì)的pI值相接近，此時(shí)調(diào)節(jié)緩沖液的pH值對(duì)分離特別有用。在高于或低于溶質(zhì)的pI值情況下操作，可使溶質(zhì)所帶電荷改變，從而在EOF前或后流出,22,表面活性劑,在毛細(xì)管電泳中常添加表面活性劑，作為疏水性溶質(zhì)的增溶劑、與溶質(zhì)形成離子對(duì)，或作為毛細(xì)管內(nèi)壁的改性劑等，以改善分離效率。常用表面活性劑有：,陰離子十二烷基硫酸鈉（SDS）陽(yáng)離子-十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）兩性離子-N,N二甲基胺-3-丙烷-1-磺酸,23,手性選擇劑,在操作緩沖液中加入少量手性試劑可以實(shí)現(xiàn)手性分離。常用的手性試劑有：環(huán)糊精、冠醚、膽汁鹽等選擇手性試劑的種類、濃度或添加醇類、表面活性劑、金屬離子等可提高選擇性,24,溫度與毛細(xì)管內(nèi)壁改性,溫度恒溫是消除焦耳熱的主要目的，但溫度也可作為一個(gè)優(yōu)化分離的參數(shù)。通過調(diào)節(jié)溫度來改變?nèi)芤吼ざ?、EOF和分析時(shí)間，以達(dá)到分離目的毛細(xì)管內(nèi)壁改性在分離生物大分子物質(zhì)如蛋白質(zhì)時(shí)，由于它們可被毛細(xì)管內(nèi)壁強(qiáng)烈吸附,使分離效率大大降低。需對(duì)毛細(xì)管內(nèi)壁改性：永久性改性硅烷化動(dòng)力學(xué)去活操作緩沖液中加改性劑,25,例 氯芐律定對(duì)映體在家兔體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究,電泳條件：羧甲基環(huán)糊精衍生物(CM-CD)為手性拆分劑, 最佳濃度5mmol/L毛細(xì)管柱48cm58m75mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH2.3）UV檢測(cè)波長(zhǎng)200nm電遷移進(jìn)樣(20kV16s)電壓20kV,柱溫20C,26,討論：,用酸性緩沖液體系，有效控制了毛細(xì)管內(nèi)電滲流電遷移進(jìn)樣可以消除血漿中酸性或中性內(nèi)源性物質(zhì)的干擾，使被測(cè)物有選擇地進(jìn)樣采用柱上場(chǎng)放大堆積濃集樣品，在進(jìn)樣前先在毛細(xì)管進(jìn)樣口引入一個(gè)短的稀緩沖液水柱，因樣品離子的電泳速度與電場(chǎng)強(qiáng)度成正比，故使樣品塞中離子堆積在高濃度緩沖液界面上從結(jié)構(gòu)看，本品手性碳藏于四環(huán)體系中，用一般的CD難以分離兩對(duì)映體，衍生酸性羧甲基后可與藥物的堿性基團(tuán)發(fā)生靜電吸引，有利于手性識(shí)別,27,膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜（MECC或MEKC）,MECC是電泳技術(shù)與色譜技術(shù)的交叉，也是唯一既能分離中性物質(zhì)又能分離帶電組分的電泳技術(shù)。把表面活性劑加到緩沖液中，在表面活性劑的臨界濃度以上，單個(gè)表面活性劑之間聚集形成膠束。疏水性一端聚在一起朝向里，帶電荷的一端則朝向緩沖液,28,MECC的作用原理,表面活性劑分子和膠束通常是帶電的，以與EOF相同或相反的方向移動(dòng)，但EOF的移動(dòng)速度一般較膠束快,29,選擇性與分離度,通過選擇不同的表面活性劑，改變緩沖液濃度、pH值和操作溫度，使用添加劑（尿素、金屬離子、手性試劑），加入有機(jī)修飾劑（甲醇、乙腈、異丙醇）等來控制溶質(zhì)與膠束之間的相互作用，以提高色譜的選擇性在分離中性物質(zhì)時(shí)，所有溶質(zhì)都在t0與tm之間流出。親水性溶質(zhì)隨EOF流出，被膠束完全保留的溶質(zhì)隨膠束流出?？刂茥l件，采用中等程度的EOF和高遷移率的膠束，以擴(kuò)大時(shí)間窗口，提高分離度,30,中性溶質(zhì)的流出時(shí)間窗口示意圖,31,例1 兔血漿中氟比洛芬的測(cè)定,電泳條件：75m100cm毛細(xì)管柱分離電壓30kV, 溫度30C虹吸進(jìn)樣30sUV檢測(cè)波長(zhǎng)254nm分離緩沖液為20mmol/L硼砂含25mmol/LSDS, pH9.02討論:硼砂緩沖液中加入SDS可包裹血漿中蛋白質(zhì)，減少蛋白質(zhì)對(duì)分離測(cè)定的干擾和對(duì)柱的污染,32,例2 高效毛細(xì)管電泳法測(cè)定注射用水溶性維生素的含量,采用膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜法，分離分析注射用水溶性維生素制劑中VB1、VB12、VB6、VC、煙酰氨、葉酸、D-生物素、核黃素磷酸鈉、泛酸鈉9種成分 電泳條件：未涂層熔融石英毛細(xì)管(67cm50m，有效長(zhǎng)度55cm)運(yùn)行緩沖液為50 mmol/LSDS-50 mmol/L的硼酸鈉（pH 8.33）檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm壓力進(jìn)樣（6.89KPa10 s）運(yùn)行電壓15.0 kV；毛細(xì)管柱溫25,33,分析前毛細(xì)管處理,每天分析之前，分別依次用1 mol/L氫氧化鈉溶液、高純水、運(yùn)行緩沖液沖洗5, 10, 10 min每次分析之間分別用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液、高純水、運(yùn)行緩沖液沖洗毛細(xì)管3, 5, 5 min,34,測(cè)定方法,取約1.5g的內(nèi)容物，精密稱定，置于10ml量瓶中，用水沖洗瓶?jī)?nèi)壁，洗液與樣品合并，加水溶解并稀釋至刻度，混勻。用0.22m微孔濾膜過濾后，在上述電泳條件下進(jìn)樣，記錄維生素B12和D-生物素的峰面積另精密量取上述樣品溶液1.0ml,置于100 ml量瓶中，加水稀釋至刻度、搖勻，同法測(cè)定，記錄VB1,VB6,VC、煙酰氨、葉酸、核黃素磷酸鈉、泛酸鈉的峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算樣品含量,35,測(cè)定結(jié)果,測(cè)得各種成分按標(biāo)示量計(jì)算的百分含量（%）在97.50.9到103.80.7之間（n=3）制劑中9種成分的毛細(xì)管電泳圖如下：,1-煙酰氨； 2-VB6；3-D-生物素；4-核黃素磷酸鈉；5-VB12；6-VC；7-泛酸鈉；8-葉酸；9-VB1,混合對(duì)照液,制劑,36,毛細(xì)管電色譜（CEC）,將HPLC中的固定相填充到毛細(xì)管中作為固定相，以電滲流為流動(dòng)相的驅(qū)動(dòng)力，利用樣品與固定相的相互作用的差異而達(dá)到分離,分離柱,檢測(cè)器,分流控制閥,反壓閥,高壓電源,37,例 氟西汀和西替利嗪對(duì)映體的雙動(dòng)態(tài)吸附毛細(xì)管電色譜手性分離,以SO3-CD為手性選擇劑，海美溴銨(HDB)為陽(yáng)離子表面活性劑，在Tris-H3PO4 (pH3.0)的體系中分離了氟西汀和西替利嗪對(duì)映體色譜條件毛細(xì)管柱35cm50m, 有效長(zhǎng)度30cm壓力進(jìn)樣：13.8 kPa4s；分離電壓15kV紫外檢測(cè)210nm；分離柱溫25C,38,討論,采用HDB作添加劑使形成雙動(dòng)態(tài)涂層，反轉(zhuǎn)電滲流，采用正極檢測(cè)，大大縮短分析時(shí)間在20mmol/L Tris-H3PO4 (pH3.0)條件下，HDB含量0.1g/L，SO3-CD 20mmol/L，氟西汀和西替利嗪對(duì)映體在較短的時(shí)間內(nèi)達(dá)到良好分離pH2時(shí)石英毛細(xì)管壁的硅羥基不解離，即使加入HBD也無(wú)法形成雙動(dòng)態(tài)吸附。當(dāng)pH增加到3時(shí)，硅羥基發(fā)生解離后而帶負(fù)電，帶正電的HBD通過靜電作用在柱內(nèi)形成第一動(dòng)態(tài)涂層，而后再靜電吸附一層負(fù)電性的SO3-CD，雙動(dòng)態(tài)吸附的形成導(dǎo)致分析物R值的增大,39,例 梯度加壓毛細(xì)管電色譜同時(shí)分離大黃提取液中5種蒽醌類化合物,毛細(xì)管電色譜主要是以電驅(qū)動(dòng)流動(dòng)相為主要的分離模式，而壓力流驅(qū)動(dòng)毛細(xì)管電色譜是以液相色譜泵為流動(dòng)相的主要驅(qū)動(dòng)力，它克服了僅靠電滲流驅(qū)動(dòng)的一些限制因素，可方便地對(duì)流動(dòng)相的組成、性質(zhì)和流速進(jìn)行調(diào)節(jié)，尤其是能夠?qū)崿F(xiàn)流動(dòng)相梯度洗脫，是毛細(xì)管電色譜法發(fā)展的重要方向,40,色譜條件,C18熔硅毛細(xì)管柱（27cm75 m），有效長(zhǎng)度20cm流動(dòng)相A組成：醋酸-醋酸鈉緩沖溶液(pH=4.5) ；流動(dòng)相B組成：乙腈流動(dòng)相流速0.08mL/min進(jìn)樣閥定量進(jìn)樣20nL在260nmUV柱上檢測(cè)-3kV 電壓下，大黃酚、大黃素、大黃素甲醚、蘆薈大黃素和大黃酸5種成分得到最好分離效果,41,AE為5種梯度（不加電壓）,在上述C梯度條件下，改變電壓,最佳,分離結(jié)果,42,多種色譜技術(shù)提供了不同的選擇性,43,四、毛細(xì)管電泳儀裝置示意圖,44,進(jìn)樣,進(jìn)樣體積一般是不知道的，進(jìn)樣量通常用壓力與時(shí)間或電壓與時(shí)間表示。（注意：樣品區(qū)帶的長(zhǎng)度應(yīng)不超過毛細(xì)管總長(zhǎng)度的1%-2%）。方法有：流體力學(xué)方式在進(jìn)樣端加氣壓在出口端抽真空利用虹吸現(xiàn)象,45,虹吸,氣動(dòng)進(jìn)樣示意圖,46,電動(dòng)進(jìn)樣,用樣品管替換緩沖液管，施加電壓來完成進(jìn)樣。這種進(jìn)樣方式的進(jìn)樣量取決于組分的電泳淌度，對(duì)于離子型組分有進(jìn)樣歧視，遷移速度快的離子比遷移速度慢的離子進(jìn)去得要多一些。,47,毛細(xì)管,熔融石英毛細(xì)管有效長(zhǎng)度為5075cm，總長(zhǎng)度一般比有效長(zhǎng)度多515cm，內(nèi)徑為2075m。毛細(xì)管使用前后需用堿液、緩沖液沖洗毛細(xì)管溫度的控制對(duì)于操作重現(xiàn)性很重要，常采用液體恒溫或空氣恒溫方式，前者比較有效，后者儀器裝置簡(jiǎn)單、操作方便毛細(xì)管電泳所用高壓電源要能提供30kV的直流電壓和200300 A的電流。最好使用雙極性電源，能進(jìn)行極性切換,48,泡狀池示意圖,光源,檢測(cè)器,毛細(xì)管電泳的檢測(cè)方式是采用柱上檢測(cè)，透光窗直接開在毛細(xì)管上，不存在死體積和組分混合而產(chǎn)生譜帶展寬現(xiàn)象,49,五、毛細(xì)管電泳與其它技術(shù)聯(lián)用,毛細(xì)管電泳與其它技術(shù)聯(lián)用拓寬了毛細(xì)管電泳的應(yīng)用范圍。例不同電泳技術(shù)間的聯(lián)用（等速電泳與區(qū)帶電泳聯(lián)用，CITP-CZE）高效液相與毛細(xì)管電泳聯(lián)用（HPLC-HPCE）毛細(xì)管電泳與質(zhì)譜聯(lián)用免疫分析與毛細(xì)管電泳聯(lián)用毛細(xì)管電泳免疫分析。利用抗原抗體復(fù)合物與游離抗原、抗體在電泳行為上的差異，將毛細(xì)管電泳作為免疫分析的檢測(cè)手段,50,例1：毛細(xì)管液相/毛細(xì)管電泳二維系統(tǒng),小承氣湯 uHPLC:EP-250-80-5-C18(A)CH3OH;(B)H2OMEKC:36cmx75um30mM SDS,8mM NaBr,5mM K2HPO421kv210nm,51,例2：二維毛細(xì)管電泳電化學(xué)檢測(cè)尿樣中的-阻斷劑,設(shè)計(jì)制作了在柱電化學(xué)(EC)檢測(cè)池，用于在同一根毛細(xì)管中進(jìn)行中心切割二維毛細(xì)管電泳(2D-CE)在線純化分離檢測(cè)尿樣中的6種-阻斷劑尿樣先在15 mmoL/L NaAc緩沖液中進(jìn)行毛細(xì)管區(qū)帶電泳(CZE)分離，帶正電荷的-阻斷劑與中性和帶負(fù)電荷的干擾物質(zhì)分成不同區(qū)帶然后在檢測(cè)端施加13.8 kPa壓力將干擾成分從毛細(xì)管入口端排出，同時(shí)將目標(biāo)組分驅(qū)送到毛細(xì)管入口端,52,二維毛細(xì)管電泳電化學(xué)檢測(cè)尿樣中的-阻斷劑,最后在90 mmoL/L NaAc-30 mmoL/L SDS緩沖液中進(jìn)行膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜(MEKC)分離場(chǎng)放大樣品堆積(FASS)膠束推掃在柱雙重富集技術(shù)不僅有效抵消壓力驅(qū)送過程中產(chǎn)生的區(qū)帶擴(kuò)散，還可進(jìn)一步壓縮樣品區(qū)帶，提高檢測(cè)靈敏度。,53,CE-EC在柱檢測(cè)裝置,為在柱EC檢測(cè)，制作了蝕刻場(chǎng)隔離接頭。距毛細(xì)管出口端1.5cm處，用刀將毛細(xì)管一側(cè)的聚酰亞胺涂層刮掉5mm，去掉涂層的部分毛細(xì)管放置在40HF溶液中蝕刻3h形成一段多孔膜，在該處均勻涂敷一層醋酸纖維素漿，待凝固后，即形成只通過電流而無(wú)溶液泄漏的場(chǎng)隔離接頭。,54,方法設(shè)計(jì),單純采用MEKC，尿中共存組分，如尿酸、抗壞血酸、氨基酸等對(duì)6種-阻斷劑測(cè)定有干擾根據(jù)6種-阻斷劑都是弱堿性化合物（pKa=8.7-9.7），在pH 4.3的NaAc-HAc緩沖液中帶正電荷，電泳淌度與電滲流方向一致，在CZE條件下遷移較快，而部分干擾成分在該條件下為中性或陰離子化合物，遷移較慢。在90 mmoL/L NaAc-HAc(pH 4.3)緩沖液中，6種-阻斷劑與干擾成分得到分離,55,MEKC與CZE分離色譜圖,56,2D-CE在線純化分離尿樣中-阻斷劑的方法,毛細(xì)管內(nèi)先充滿CZE 15 mmol/L NaAc-HAc緩沖液，10 kV電動(dòng)進(jìn)樣10 s，鼠尿樣品在l0 kV下進(jìn)行CZE分離。當(dāng)工作電極檢測(cè)到-阻斷劑的信號(hào)時(shí)立即停止分離電壓；檢測(cè)端換為MEKC 90 mmol/L NaAc-HAc-30 mmol/L SDS緩沖液，并在檢測(cè)端施加13.8 kPa N2壓力，溶液以0.2 cm/s的速度流向進(jìn)樣端，干擾物質(zhì)從進(jìn)樣端排出毛細(xì)管，根據(jù)毛細(xì)管有效長(zhǎng)度(59.5cm)和液流速度(0.2 cm/s) , -阻斷劑在298 s時(shí)到達(dá)進(jìn)樣端(為防止損失,290 s時(shí)停止N2壓力);同時(shí)MEKC緩沖溶液進(jìn)入毛細(xì)管中。進(jìn)樣端換成MEKC緩沖溶液， -阻斷劑在10 kV下進(jìn)行MEKC分離。經(jīng)一維CZE分離純化后，二維MEKC分離待測(cè)物時(shí)無(wú)干擾峰。,57,雙重富集作用,第二維分離,第一維至第1個(gè)峰被檢出,壓力驅(qū)送過程,MEKC放大圖,FASS和推掃雙重富集,第一維分離結(jié)束后，待測(cè)組分處于15 mmol/L NaAc-HAc緩沖液中，離子強(qiáng)度遠(yuǎn)低于第二維背景緩沖液(90 mmol/L NaAc-HAc-30 mmol/L SDS)，在緩沖液界面處進(jìn)行FASS的同時(shí)被迎面而來的SDS膠束捕獲，使樣品區(qū)帶得到雙重壓縮,58,例3：毛細(xì)管電泳等離