【畢業(yè)學位論文】（Word原稿）黃瓜性型遺傳規(guī)律及性別決定相關基因的分布和表達研究-蔬菜遺傳資源與生物技術碩士論文

I 摘 要 黃瓜 (.)屬葫蘆科（ 、 甜瓜屬（ 、 一年生草本蔬菜作物。黃瓜 是世界性的重要蔬菜。我國是世界上黃瓜栽培面積最廣 、總產(chǎn)量最高的國家。 雌花節(jié)率的高低是影響黃瓜產(chǎn)量的重要因素。同時，利用黃瓜全雌性品系能極大地簡化雜交種的制種工作。由于黃瓜性別表現(xiàn)和遺傳機制的復雜性，利用傳統(tǒng)的方法進行性別調控和雌性的育種效率不高。因此深入研究黃瓜性 型 的遺傳規(guī)律，認識黃瓜性別決定相關基因在不同性型黃瓜種質資源中的分布及表達特征，對全面理解黃瓜性別分化 的機理，加快雌性品系的選育具有重要的意義， 同時 可為性別決定基因的分離克隆、體外重組與遺傳轉化奠定基礎。本試驗從三個方面進行了研究，得到如下研究結果 ： 強雌性系“ 1613別與普通性型株系“ 交、自交 和回交 ，獲得了兩個組合的 個群體。通過對各組合 世代植株性型的定性觀測，并經(jīng) 2 測驗，發(fā)現(xiàn)全雌和強雌性狀 分別 由一對不完全顯性等位基因控制。以兩個組合的 體的數(shù)據(jù)為基礎，進一步對性型進行了數(shù)量遺傳學的分析，表明全雌性性狀 和 強雌性性狀均是由一對主基因控制，而且存在微效多基因。在全雌性組合中，主基因的遺傳率為 微效多基因的遺傳率為 在強雌性組合中，主基因的遺傳率為 微效多基因的遺傳率為 法，檢測了黃瓜性別決定相關基因 化酶基因 乙烯受體基因 78 份不同性型的黃瓜材料中的分布，發(fā)現(xiàn)這 5 個基因均存在于所有材料 的 基因組 中，不具有 性 型 特異性。還對 行了克隆， 序列分析證明 擴增 產(chǎn)物正是 酶基因 明多數(shù)學者認為的有雌性特異性的結論不具有廣泛的適用性。 法研究了 酶基因 化酶基因 烯受體基因 全雌性材料“ 強雌性材料“ 1613“ 106普通性型材料“ 西雙版納黃瓜“ 或不經(jīng)性別誘導處理后 8個時間段的 表達特征。結果發(fā)現(xiàn)，就每一個基因在不同性型材料中的表達來看， 酶基因所有樣品中均未表達，說明該基因在苗期的自然表達與否，與后期植株的性型表現(xiàn)沒有直接的關系，與前人的研究結果基本一致。 化酶基因大多表現(xiàn)瞬時或間歇性表達，且僅在 全雌性材料和普通性型材料中，表現(xiàn)了與雌性的一定程度的協(xié)同關系。 乙烯受體基因 強雌性材料“ 106瞬間表達，硝酸銀明顯抑制了其表達，而在普通性型材料中均未表達，表現(xiàn)了與雌性材料的特異協(xié)同關系；乙烯受體基因 所有樣品中均有表達，且硝酸銀能抑制其表達（除“ 1613），乙烯利促進其表達，其在 5 個材料中的表達與雌性的表現(xiàn)有 一定 的相關性。就所有基因在同一材料中的表達來看，在全雌性黃瓜材料中， 化酶基因 烯受體基因 個雌性相關基因得到了表達，并且均表現(xiàn)了與雌性的相關性。在強雌材料“ 1613， 表達， 但 兩個 化酶基因的表達在硝酸銀處理后反而被促進，乙烯受體基因在處理和對 照中的表達 無差異 。在強雌材料“ 106， 4 個基因均有表達，兩個 化酶基因的表達與在“ 1613的表達有相似之處，兩個乙烯受體基因的表達則表現(xiàn)出與雌性的協(xié)同關系。在普通性型材料“ ， 除 的 化酶基因和乙烯受體基因均有表達，且與雌性表現(xiàn)存在一定的協(xié)同關系。在西雙版納黃瓜中，僅有 個雌性相關基因表達，并表現(xiàn)出與雌性的協(xié)同關系?？梢姡總€性別決定基因在植株的 性別表現(xiàn) 中 并非具有同等效應和同樣的協(xié)同關系；不同性型材料的性別表現(xiàn)可能受 不同性別決定基因的表達消長和調控。 關鍵詞 ： 黃瓜 (.)， 性別決定相關基因， 遺傳分析， 分布， 半定量 .) is is of in of in is a of As of of on of of to .) is to of In it in of on as 1. 2 , of 1613 2 of in it by of of of It in of of of of of of of 1613 of 2. of to 8 of by CR on of be in It to to 9%. in 3. of to CC on 1613106 a CC t in 0 at of to or in CC or in in of CC be in in 106 IV in 0 to 1613, to on in in of In 1613 In 106 CC in In of In a , It be of t on to in be of be by .), to V 目 錄 第一章 文獻綜述 . 1 瓜性別分化及表現(xiàn)的研究進展 . 1 瓜性別分化和性別表型類別 . 1 瓜性別決定的機制 . 3 瓜性別決定的分子基礎 . 5 異引物 測方法 . 7 異引物 . 7 測方法 . 7 研究的目的和意義 . 11 第二章 黃瓜性型遺傳規(guī)律的研究 . 12 料與方法 . 12 料 . 12 法 . 13 果與分析 . 15 質量性狀的 分析方法 分析 . 15 數(shù)量性狀的 分析方法 分析 . 16 論 . 20 第三章 黃瓜性別決定相關基因在不同性型黃瓜種質基 因組中的分布 . 21 料和方法 . 21 驗材料 . 21 驗方法 . 22 果與分析 . 26 提取的 量檢測結果 . 26 因在不同性型黃瓜種質基因組中的分布 . 27 因的克隆 . 28 化酶基因在不同性型黃瓜種質基因組中的分布 . 31 烯受體基因在不同性型黃瓜種質基因組中的分布 . 32 論 . 33 第四章 黃瓜性別決定相關基因的表達特征研究 . 35 料和方法 . 36 驗材料 . 36 驗方法 . 36 果與分析 . 38 處理的植株性型表現(xiàn) . 38 增各基因的循環(huán)次數(shù)確定 . 39 表達特征 . 41 論 . 45 第五章 全文結論 . 47 瓜的性 型 遺傳規(guī)律 . 47 瓜性別決定相關基因在不同性型黃瓜種質基因組中的分布 . 47 瓜性別決定相關基因的表達特征研究 . 48 參考文獻 . 49 致謝 . 54 作者簡歷 . 55 中國農(nóng)業(yè)科學院 碩 士學位論文 第一章 文獻綜述 1 第一章 文獻綜述 瓜性別分化及表現(xiàn)的研究進展 瓜性別分化和性別表型類別 瓜的性別分化過程 黃瓜的性別分化過程比較復雜，無論是雌花還是雄花最初都是兩性的，其后發(fā)生雌雄性器官中的一方停止發(fā)育即所謂的選擇性敗 育形成單性的雄花或雌花 （ 齋藤隆， 1982） 。雌雄單性同株類型的黃瓜其性器官的選擇性敗育發(fā)生在形態(tài)發(fā)生晚期 ;從分生組織形成花原基后，首先在其周邊外緣隆起形成 萼片 ，繼而在其內(nèi)側形成花瓣初生突起，花瓣發(fā)育時，在其內(nèi) 側形成雄蕊和雌蕊的原基。在花芽分化發(fā)育的早期均為兩性花 ，即雌雄蕊原基并行發(fā)育，其后則發(fā)生雌雄蕊一方選擇性敗育而形成單性的雄花和雌花。 (1960)曾利用解剖鏡對黃瓜雌、雄花形態(tài)發(fā)生的部分階段進行過簡單的形態(tài)學描述，并把它的發(fā)育過程分為 5 個階段， 990)通過掃描電鏡對黃瓜 花芽形態(tài)發(fā)生進行了詳細的觀察。 960) 、 任吉君等 (1994)的研究表明黃瓜單性花分化和發(fā)育過程中經(jīng)歷了無性期、兩性期和單性期，最終只有一種性別的性器官原基發(fā)育成有功能的性器官，從而形成單性花，而對單性花中器官發(fā)生原理以及對未形成有功能器官的相反性別原基的研究報道甚少。 (2002)通過對黃瓜雌花中敗育雄蕊進行形態(tài)學觀察和生化分析發(fā)現(xiàn)雄蕊敗育主要發(fā)生在雄蕊的花藥原基階段， 析表明，敗育與 傷 (切相關，但 傷并沒有導致細胞解體 ( 但是到目前為止還沒有詳細比較黃瓜雌雄花性別分化過程中形態(tài)學特征差異以及詳細的器官形成過程的報道，也還不清楚黃瓜雌雄花發(fā)育的哪個階段最初出現(xiàn)形態(tài)學上的差異以及具體的形態(tài)學差異。 瓜性別分化的影響因素 黃瓜性別分化主要受遺傳因子、環(huán)境條件和激素的調控。 環(huán)境條件對黃瓜性別分化的影響 環(huán)境因子在黃瓜的性別分化中起著重要的作用， 影響 黃瓜性型分化的影響主要 因素有：溫度、光照、水分和施肥等 。 大量生產(chǎn)實踐和科學實驗證明，高 溫 和 長 日照 促進黃瓜雄花分化； 低 溫 和 短 日照 則 促進花芽向雌型轉變，有利于雌花形成。溫度主要是夜間低溫的影響 （ 李利敏， 1993） 。通常認為促進雌花分化的有利溫度是白天 25 ， 夜溫 12 15最有利于雌花分化 （ 黃偉波， 1996） 。 在 黃瓜 第 1葉到第 4 5葉，進行低溫處理（ 14 15 ），便可增加雌花數(shù)目和降低雌花節(jié)位 。 黃瓜屬于日中性植物，開花與日照關系不大，但短時強光照（ 8小時為最佳）條件有利于雌花的發(fā)生，尤其是在幼苗期，縮短日照條件能促進雌花形成 （ 李利敏， 1993） 。 5 6小時的日照雖有促進雌花發(fā)生的效果，但不利于黃瓜的生 產(chǎn)， 12小時以上的長日照有促進雄 花發(fā)生的作用。 環(huán)境條件中的濕度狀況與黃瓜性別分化有密切關系（米寧娜， 1957）。土壤濕度越大越有利于雌 花分化 。 同樣，在較高的空氣濕度下，雌性器官的發(fā)育比雄性器官的發(fā)育更順利，而且正在分化中的花原基對空氣濕度的變化最敏感。在進行花芽分化時，保持空氣濕度 80%比在 40%的情況中國農(nóng)業(yè)科學院 碩 士學位論文 第一章 文獻綜述 2 下，花的總數(shù)，特別是雌花數(shù)增加得多。 不同礦質營養(yǎng)條件對黃瓜性別反應是不同的，氮素營養(yǎng)有利于雌花的形成，在光合作用強而碳素營養(yǎng)良好的條件下，供給氮素有增加花數(shù)的作用，尤其是雌花增加多，但氮素供應過多，則不利于雌花的分化；鉀素營養(yǎng)有利于雄花 的形成。 氮和磷分期施用有利于雌花的形成，但分期施用鉀肥時，反而利于雄花的形成。 增加空氣中二氧化碳的含量 可提高光合產(chǎn)量 ，從而 增加雌花的數(shù)量。 乙炔也有增加雌花的功能。 激素對性別分化的影響 不同的研究者對激素影響黃瓜性別分化的觀點不 完全 相同，但一般認為，赤霉素（ 硝酸銀（ 硫代硫酸銀（ 乙烯生物合成抑制劑氨基氧乙酸 (氨基乙氧基乙烯甘氨酸（ 可 促進其多開雄花，而乙烯利生長素類物質及生長抑制劑等都可促進其多開雌花。不過，在不同的植物物種上有相反的報道，例如用赤霉素處理 絲瓜、板栗會減少其雄花數(shù)，增加雌花數(shù)（ 應 振 土 等， 1989）。 乙烯是黃瓜性別決定的一個重要調節(jié)因素 （ et 1997） 。黃瓜幼苗期用乙烯利處理，有提高第一雌花著生節(jié)位的作用，并能增加黃瓜的雌花數(shù) （ et 1997） 。內(nèi)源乙烯在純雌系與雌雄同株系中的釋放速度是不一致的，純雌系中要慢些，但其含量以純雌系植株中為最高，純雄株中最少 （ et 1999） 。應振 土 等（ 1990）研究表明黃瓜雌性越強的品種，其莖尖組織乙烯釋放量越多。在雌雄同株黃瓜植株中，乙烯誘導 雌花的形成；在雄全同株的黃瓜中則誘導兩性花的形成。吳葉青（ 2000）研究表明乙烯會抑制雌性黃瓜中雄蕊的生長，但在雄全同株黃瓜中卻不能。生長素雖然促進雌花的形成，但最強大的雌性作用是由乙烯產(chǎn)生的。乙烯生物合成或作用的抑制劑能抑制雌花的發(fā)育，并誘導雄花的發(fā)生（ 976， 979）。在雌性黃瓜中，用 會導致雌性向雄性的性別轉變（ et 001， et 997），這是由于抵消了 而增強雄蕊的發(fā)育 （ et 1997） 。 1962）用萼片、花瓣和雄蕊原基發(fā)育良好的外植體，在改良的 現(xiàn) 表現(xiàn)為促進雌性表達。陳學好等 (2001)發(fā)現(xiàn)在黃瓜性別逆轉的過程中，不同的激素會發(fā)生不同的變化。 在雌性轉雄過程中，莖尖赤霉素 (腐胺 (可溶性蛋白質 (量升高，而生長素 (細胞分裂素 (亞精胺 (量則下降。與此相反，在 雄性轉雌過程中，莖尖赤霉素、腐胺和可溶性蛋白質含量下降，而生長素、細胞分裂素和亞精胺含量升高。脫落酸、精胺和尸胺在黃瓜雌雄性別逆轉過程中則表現(xiàn)為無規(guī)律的變化。 后來，陳學好等 (2002)又發(fā)現(xiàn)內(nèi)源 通過誘導 而促進雌性表達。 1960年 決了雌性系選育和留種的難題。赤霉素促進雄花的形成，用赤霉素處理雌性植株可誘導雄花，這可能是導致了雌性花芽的敗育和偶然的雄性花芽的形成（ et 999， et 001）。 970)、羅宗洛 (1973)等認為乙烯和赤霉素無對抗作用。于 鳳 鳴等 (1997)也得出同樣的結論，說明乙烯利和赤霉素在調控黃瓜性別分化方面存在著量的平衡問題，該結論與夏仁學 (1996)的觀點是一致的，即性別分化是由植物體內(nèi)源激素赤霉素、乙烯、生長素和細胞分裂素的平衡來調節(jié)的。 中國農(nóng)業(yè)科學院 碩 士學位論文 第一章 文獻綜述 3 黃瓜性別分化的主要影響因子是遺傳因子，有關方面的研究進展將在下一節(jié)黃瓜性別決定的機制中一并闡述。 瓜性別的表現(xiàn)類別 由于黃瓜性別分化的過程復雜，影響 因素較多，性別表型類別也多樣。根據(jù)單個植株上花的類型，可分為純雌株、強雌株、雌全株、雌雄全株、雌雄株、完全株、雄全株、純雄株八種類型（ 譚其猛， 1980） ，其含義見下表 1 表 1瓜性別分類及含義 of of 黃瓜性別決定的機制 瓜性別決定的生化機制 黃瓜是以果實為收獲對象的瓜果類作物，在較多雌花基礎上的高結成率是獲得高產(chǎn)的基礎。因此，研究黃瓜的性別分化或性別決定機理及其遺傳標記，進行性別調控，尤其是在幼苗期進行植株性別的鑒定，具有重要的理論意義和實踐價值。 遺傳標記的研究是植物性別分化及調控研究的重要手段。研究應用較多的主要有形態(tài)標記、細胞標記、蛋白質標記、同工酶標記和分子標記等。由于分子生物學技術的發(fā)展，同工酶、蛋白質等生物大分子分析技術 的完善，以及分子標記技術的日趨成熟，使得遺傳標記的研究在揭示植物性別分化機理中起著越來越重要的作用。 性別類型 義 雌株 在主蔓和子蔓上都是雌花。 強雌株 植株上除雌花外有少量雄花。 雌全株 在主蔓上先有一段完全花節(jié)，其后是雌花和完全花相間隔的段落。 雌雄全株 主蔓上先有一段雄花節(jié)，其后是一段雄花、完全花、雌花相間的段落， 再后是雌花為主的段落。 雌雄株 主蔓上先有一段雄花節(jié)，其后一段上雌花雄花相間著生，有時后期有 一段連續(xù)雌花。 完全株 主蔓最初幾節(jié)是雄花或兩性花，其后為連續(xù)兩性花節(jié)，側枝上只有兩性 花，每一兩性花節(jié)的第二朵以后的花也可能是雄花，有時還有雄花和兩性花之間的過渡花型。 雄全株 最初幾節(jié)是雄花，繼以一段完全花（或雌花）和雄花相間的節(jié)，其后都 是完全 花。 純雄株 植株上全是雄花。 中國農(nóng)業(yè)科學院 碩 士學位論文 第一章 文獻綜述 4 大多數(shù)植物的單性花發(fā)育早期階段兩種性器官原基均被啟動，隨后由于基因、環(huán)境及激素等因素復雜的相互作用導致一種性器官原基發(fā)育停滯或敗育，另一種性型占優(yōu)勢而發(fā)育成該種單性花。因此，研究花器官發(fā)育過程中基因表達的特異大分子，分析并測定其結構，制作成探針（ 利用原位雜交技術定位性別分化特異基因或分離相關基因，是進行性別決定基因的研究并進行調控的重要途徑。性別分化過程中大分子標記物主要有蛋白質如同工酶、特 異 中蛋白質是性別分化中最重要的大分子標記物（壽森炎等， 2000）。特異蛋白質分子標記的研究方法主要有聚丙烯酰胺凝膠雙向電泳和聚丙烯酰胺凝膠印跡轉移電泳，前者包括 林鳴等 (1996)在黃瓜器官特異蛋白的研究中，利用 現(xiàn)雄蕊的 及花柱中的 別為各自器 官中的器官特異蛋白質。 汪俏梅等(1998)在苦瓜 (.)研究中發(fā)現(xiàn)了一些與苦瓜性別分化相關的特異蛋白，并提出其中一個 11鍵蛋白”與雌性分化有關，另一個 30鍵蛋白”與雄性分化有關。 酶是基因表達的直接產(chǎn)物，同工酶譜的器官組織特異性也反映了基因表達的特異性。目前與性別分化有關的同工酶研究大多集中在過氧化物酶同工酶和酯酶同工酶在雌雄器官中的差異研究，其方法與特異蛋白質分子研究相似。艾辛等 (2000)研究黃瓜二葉期時子葉和真葉中的過氧化物酶、多 酚氧化酶和超氧化物歧化酶同工酶與黃瓜性別表現(xiàn)的關系發(fā)現(xiàn)，純雌株比雌雄株酶活性強、酶帶數(shù)量多，可作為黃瓜純雌株早期鑒定的標記，尤其是真葉中多酚氧化酶同工酶 定成功率高。李曙軒等 (1979)也曾報道瓠瓜與黃瓜在雌性化或雌性越強的品種中過氧化物同工酶的活性就越強，且在黃瓜中過氧化物同工酶的活性與雌雄的比值呈正相關。 瓜性別決定的遺傳機制 關于黃瓜的性別遺傳，早在 1928年， 一對基因控制。 .(1961) 提出至 少三類基因控制黃瓜性別表現(xiàn)：第一類基因 二類為微效多基因，控制某種未知基質的累積或缺乏，它調節(jié)第一類基因的表現(xiàn)。第三類基因 （ 1961）提出有一群微效基因和兩對主要基因控制性變： .（ 1974）發(fā)現(xiàn)了兩個新的控制黃瓜性型的隱性基因，即 以及 一步的對黃瓜性別表現(xiàn)的遺傳學分析證明，黃瓜植株的性別受多個位點控制， 并已鑒定出影響黃瓜性別表達的七個不連鎖基因位點（表 1 991，略有改動），其中 m、 顯性 F（ 控制雌花產(chǎn)生的主要基因位點， 雌性增強子 修飾， a（ 點則在 991；孟繁靜， 2000）。 陳惠明等（ 1999） 采用經(jīng)典遺傳學方法，研究黃瓜純雌株分別與雌雄同株、雄全株雜交及強雌株分別與雌雄同株、純雌