【畢業(yè)學(xué)位論文】（Word原稿）甲狀旁腺素對人甲狀腺髓樣癌細(xì)胞調(diào)控作用的實(shí)驗(yàn)研究

1 第一章 研究綜述 狀腺髓樣癌 狀腺髓樣癌的起源 甲狀腺癌是最常見的頭頸部惡性腫瘤，也是近年來發(fā)病率增加最快的惡性腫瘤之一 1。主要有甲狀腺乳頭狀癌、 甲狀腺 濾泡狀癌、 甲狀腺 髓樣癌和未分化 型甲狀腺 癌四種病理類型。甲狀腺髓樣癌 （ 一種起源于分泌降鈣素（ 甲狀腺濾泡旁 C 細(xì)胞的較少見的神經(jīng)內(nèi)分泌瘤，雖然其占全部甲狀腺惡性病的比例小于 10%，2。降鈣素可作為 斷和術(shù) 后療效判斷的指標(biāo)，因?yàn)槠涫?異性的腫瘤標(biāo)志物， 1959 年首次描述了 組織學(xué)表現(xiàn)，認(rèn)為它是一種獨(dú)立病理類型的甲狀腺腫瘤。 1906 年本病被首次報到， 其稱為 “伴淀粉樣變的惡性結(jié)節(jié)性甲狀腺腫 ”。由于起源于屬神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的甲狀腺 C 細(xì)胞，并且與甲狀腺濾泡細(xì)胞無關(guān)，故病理學(xué)家將它歸為神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤或 狀腺髓樣癌的特征 臨床上分為散發(fā)性甲狀腺髓樣癌 (家族性 甲狀腺髓樣癌 ( 以 見 ， 占 75%3,4。 據(jù)其遺傳特點(diǎn)可分為多發(fā)性內(nèi)分泌瘤 2A 型 (A， 多發(fā)性內(nèi)分泌瘤 2B 型（ ）和無 族型 5。其發(fā)病通常是多病灶性和雙側(cè)性的。是一種由 癌基因的種系突變引起的常染色體顯性綜合征 6對 族性髓樣癌的突變分析表明有超過 30 個不同的錯義突變。許多錯義的 因突變可導(dǎo)致 學(xué)者提出這些錯義的突變與遺傳性的 3 種不同的表型相互對應(yīng) 9。目前已知這種種系 癌基因位于染色體 ，并且該原癌基因的點(diǎn)突變就能導(dǎo)致甲狀腺 C 細(xì)胞的增生 10 約 80%的遺傳性髓樣癌是以 的形式存在的 12。系 1961 年 次描述此綜合征，以 主要臨床表現(xiàn)，約50伴有嗜鉻細(xì)胞瘤 ( 30 有甲狀旁腺增生或腺瘤 (13。伴有先天性巨結(jié)腸癌和皮膚淀粉樣變苔蘚 11。巨結(jié)腸癌是由于在大腸缺乏了自主交感神經(jīng)，導(dǎo)致結(jié)腸擴(kuò)張 、 便秘 、 梗阻所致。皮膚淀粉樣變苔蘚在肩 2 上會有瘙癢的皮疹 12。 與 相比較少見，約只占 的 5%，兩者在臨床上有很大的區(qū)別。在 1966 年 次報道了 的特點(diǎn)有 膜多發(fā)性神經(jīng)瘤、 時伴有類馬凡（ 合征，并且少數(shù)患者常伴有多發(fā)性胃腸道神經(jīng)節(jié)細(xì)胞瘤，角膜神經(jīng)粗大，骨骼發(fā)育異常及發(fā)育延緩等，但無甲狀旁腺疾病 。不同的粘膜神經(jīng)瘤存在于末梢的舌、唇粘膜和結(jié)膜下區(qū)域 11。 占遺傳性 5%是以在家族中存在四個或以上受牽連的 員，并患有腎上腺髓質(zhì)或甲狀旁腺參與缺失來定義的。肉眼下癌組織呈實(shí)體狀 ， 切面灰白 ， 無明顯包膜 ， 在甲狀腺組織中呈多中心性生長。病理組織學(xué)特征為 ： 細(xì)胞呈梭形或紡錘形 ， 淀粉染色陽性，這類淀粉物質(zhì)實(shí)質(zhì)上是 C 細(xì)胞分泌的降鈣素和其它多肽類激素。 臨床表現(xiàn)與其它類型的 本相似，主要表現(xiàn)為緩慢生長的頸前腫塊，伴有或不伴有頸部淋巴結(jié)腫大或腹瀉。不同的是發(fā)病年齡偏小，病程 進(jìn)展相對緩慢 。 多表現(xiàn)為雙側(cè)甲狀腺腫塊，這與 C 細(xì)胞在甲狀腺內(nèi)分布的組織學(xué)特性有關(guān)，其在甲狀腺組織中成多中心集簇狀分布。所以有人認(rèn)為對 病人主張行全甲狀腺切除術(shù)或保留部分甲狀腺下極的近全甲狀腺切除 14。 預(yù)后好于其它類型的 甲狀腺髓樣癌 癌基因編碼一種屬于酪氨酸激酶受體蛋白家族中的成員。該受體的細(xì)胞外部分連接特殊配體 ， 連接配體后 ， 是受體間聚合及激活的過程。一旦受體被激活 ,就會發(fā)生信號的級聯(lián)放大 ， 所有信號都可以通過特殊底物磷酸化而被傳遞 15。激活 的 變在遺傳性的 占到了 95%，約 20%為散發(fā)性的。一些與腫瘤發(fā)生有關(guān)的 因的突變位點(diǎn)已經(jīng)被證實(shí)。除了 癌基因與 發(fā)病有關(guān)。甲狀腺細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)與 突變導(dǎo)致 調(diào) 16。約 98的 、 95的 和 88的 由 癌基因突變所致 17，有人認(rèn)為幾乎所有的 均是由 癌基因突變引起的，迄今為止尚未發(fā)現(xiàn) 中除 外的基因突變 13。除 ，在腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤中 達(dá)水平較 高 15, 這就提示 甲狀腺 C 細(xì)胞和腎上腺嗜鉻細(xì)胞的分化中起作用。至于在 達(dá)與甲狀旁腺增生之間有無關(guān)聯(lián)還未見報道。 狀腺濾泡旁細(xì)胞的定位與特征 甲狀腺濾泡旁細(xì)胞是具有形態(tài)和功能各異的細(xì)胞群。在正常條件下 ， 大多數(shù)濾泡旁細(xì)胞合成分泌降鈣素。然而，屬于 統(tǒng) 的濾泡旁細(xì)胞通過旁分泌和 /或自分泌分泌多種調(diào)節(jié)肽 ， 調(diào)節(jié)甲狀腺局部的生長和分泌過程也是其重要的 3 作用。來源于神經(jīng)嵴的濾泡旁細(xì)胞彌散于整個甲狀腺內(nèi) ， 并且能夠分泌多種調(diào)節(jié)肽。在哺乳動物濾泡旁細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)肽有降鈣素 、生長抑素、胃泌素、促甲狀腺激素釋放激素 ( 羧基端多肽 I 和 18。而降鈣素基因相關(guān)肽 (神經(jīng)介素 U、膽囊收縮素、分泌肽 I 在濾泡旁細(xì)胞和支配甲狀腺神經(jīng)纖維中均有分布 18。 P 物質(zhì) (血管活性腸肽 (神經(jīng)肽 (組異肽 (丙甘肽 (僅存在于甲狀腺神經(jīng)纖維中。丙甘肽往往與 存 19。研究人員通過電鏡觀察證實(shí) 20，濾泡旁細(xì)胞主要位于濾泡細(xì)胞之間 ， 細(xì)胞常插入上皮細(xì)胞之間 ， 而頂部往往被相鄰濾泡上皮細(xì)胞形成的拱狀突起 所覆蓋 ， 不直接與 濾泡腔接觸。濾泡旁細(xì)胞與濾泡細(xì)胞之間存在特殊的連接復(fù)合體 ， 使它們緊密連接起來 ， 這一形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)支持了濾泡旁細(xì)胞分泌的調(diào)節(jié)肽對甲狀腺激素的分泌起旁分泌作用的觀點(diǎn)。長期以來人們知道 ， 當(dāng)機(jī)體對甲狀腺激素的需要量減少時 ， 便可在腺體周邊濾泡腔內(nèi)看到大量含高濃度 縮的膠體聚集。在哺乳動物中這一區(qū)域很難發(fā)現(xiàn)濾泡旁細(xì)胞 ， 但其卻出現(xiàn)在無大量膠體聚集的區(qū)域。這種甲狀腺結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)說明 ， 濾泡細(xì)胞分泌甲狀腺激素時需要濾泡旁細(xì)胞分泌的調(diào)節(jié)肽的調(diào)節(jié)機(jī)制參與。調(diào)節(jié)肽經(jīng)常是經(jīng)旁分泌作用附近有其受體的濾泡旁細(xì)胞。同時 ， 當(dāng)濾泡旁細(xì)胞 和濾泡細(xì)胞胞膜上有其受體時調(diào)節(jié)肽可經(jīng)過自分泌起調(diào)節(jié)作用。此外 ， 濾泡旁細(xì)胞在區(qū)域內(nèi)不均勻分布的自然傾向 ， 對這一區(qū)域發(fā)生病變有重要意義 ， 這一現(xiàn)象在人類較常見 21。濾泡旁細(xì)胞也可通過分泌 55影響濾泡細(xì)胞的功能。根據(jù)最近研究 225為一種細(xì)胞之間信號分子經(jīng)旁分泌途徑從濾泡旁細(xì)胞到濾泡細(xì)胞 ， 并通過自分泌對濾泡旁細(xì)胞起刺激作用。 狀腺髓樣癌的診斷 診起來很困難，因?yàn)槠涑藘H表現(xiàn)為甲狀腺內(nèi)的結(jié)節(jié)外，無任何特殊的癥狀同時也缺乏特異性表現(xiàn)。只有當(dāng)腫瘤侵犯到包膜外界和 周圍的組織時才可以出現(xiàn)相應(yīng)的癥狀，如聲音嘶啞、氣道受壓等，也有部分患者有頑固性腹瀉。具特征的臨床指標(biāo)是血清學(xué)檢查，降鈣素與 顯升高，降鈣素異常升高是 異性和敏感性的腫瘤標(biāo)志物。通常遺傳性 發(fā)病是雙側(cè)性和多病灶性的 ， 且約 95% 發(fā)生在年輕人身上。在 病人中還可有并發(fā)癥，其中大約 42%為腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤、 25%伴發(fā)甲狀旁腺功能亢進(jìn) ，同時還可伴發(fā) ，此病是由胃腸道末梢神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺失引起的。的病人發(fā)病時期較早，通常在嬰兒期或兒童期 就可發(fā)病 ， 它是遺傳性惡性程度最高的一種類型 ， 該型病人可伴發(fā)腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤 ， 另外還可伴發(fā)黏膜神經(jīng)瘤 ， 胃腸道彌漫性神經(jīng)節(jié)瘤以及馬凡 (合征。家族性無甲狀腺髓樣癌病人不伴發(fā)其他任何的內(nèi)分泌腫瘤 ， 其發(fā)病年齡也比 4 的病人要大 ， 并且其病程進(jìn)展也相對較緩。 狀腺髓樣癌的治療 由于 于甲狀腺濾泡旁細(xì)胞，不具有依賴 生物學(xué)特性，也不具備攝碘功能，因此內(nèi)分泌治療和 131I 治療均無效。所以目前手術(shù)切除仍是首選的根治方式。其惡性程度介于分化型與未分化甲狀腺癌之間， 多數(shù)患者療效欠佳13,23。目前認(rèn)為 了外科手術(shù)，其它治療方法基本無效 24。放療、化療僅作為一種姑息治療方法，生物治療在晚期 初步開始應(yīng)用，但大多還處于臨床研究階段，真正用于臨床還有距離 25。經(jīng)手術(shù)治療的 者，如果血清降鈣素水平降到正常值就說明腫瘤被完整切除了。術(shù)后若血清降鈣素水平升高，表明手術(shù)切除不徹底或疾病又復(fù)發(fā)了。對 治療也以手術(shù)為主，對同時患有腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤者，應(yīng)先行嗜鉻細(xì)胞瘤切除術(shù)。因?yàn)槿粝刃屑谞钕偎铇影┦中g(shù)，有誘發(fā)高血壓危象或心衰發(fā)生的可能。 因 因突變是 病的分子學(xué)基礎(chǔ)，所以對于有關(guān)的 各種生物免疫治療，大多數(shù)是基于 因，同時， 源于甲狀腺濾泡旁細(xì)胞，組織中表達(dá)的降鈣素，降鈣素基因相關(guān)肽等在其他組織中很少表達(dá)或不表達(dá)，對其啟動子調(diào)控可以解決載體的甲狀腺靶向性問題。因此分子靶向藥物、腫瘤疫苗、單克隆抗體、自殺基因或免疫基因等已經(jīng)在臨床使用或臨床前試驗(yàn)中取得了令人鼓舞的前景 23。在 胞系實(shí)驗(yàn)中，證實(shí)此類型重組腺病毒載體可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞生長 24。隨著對甲狀腺癌生物知識的了解，已確定了一些生物靶向治 療因子。凡德他尼（ 顯著延緩局部晚期或轉(zhuǎn)移性甲狀腺髓樣癌發(fā)生和進(jìn)展的時間 26。從上述這些分子靶向治療藥物對 治療原理來看，其顯示出了誘人的應(yīng)用前景。 在問題及展望 甲狀腺癌根治術(shù)后影響生存率因素有很多，主要為手術(shù)根治程度、患者的年齡及腫瘤的臨床分期。其中對甲狀腺原發(fā)灶手術(shù)方式的選擇仍存在分歧，然而生率低，臨床表現(xiàn)多樣性，預(yù)后影響因素文獻(xiàn)報道不盡相同 25。且術(shù)后甲狀腺功能不足和甲狀旁腺功能不足等并發(fā)癥的危險明顯增加。由于甲狀腺髓樣癌具有早期轉(zhuǎn)移的特性， 多數(shù)患者術(shù)后可發(fā)現(xiàn)腫瘤殘存，所以，很有必要對甲狀腺髓樣癌進(jìn)行更多的研究，為尋找新的有效的治療方法提供理論基礎(chǔ)。 盡管對 在認(rèn)識 發(fā)病機(jī)制和相關(guān)性方面已取得進(jìn)展，然而，在對此疾病的某些方面，如個體有相同的突變但在臨床上存在異質(zhì)性方面，還沒有很好的答案， 因的多態(tài)性與 關(guān)性可能解釋這一現(xiàn)象。從臨床獲得的資料 5 經(jīng)研究證實(shí) 多態(tài)性在散發(fā)性的 起著重要的作用。然而，一些資料未能證實(shí)這些 變種與 發(fā)生或疾病的進(jìn) 展有任何的關(guān)系 27。也許不同的人種背景和研究方法的缺陷是得到上述不同結(jié)果的潛在原因，在這些方面都存在爭議 27。 生物學(xué)行為可通過分子診斷來指導(dǎo)臨床實(shí)踐 ， 變測試提高了 早期診斷率，并可減少不必要的早期及過度的預(yù)防性手術(shù)切除，提高了總體生存率 27。同時對 不同臨床表現(xiàn)的分子機(jī)制方面的研究進(jìn)展，可進(jìn)一步細(xì)化基因型 而進(jìn)一步適應(yīng)治療。 分子靶向治療藥物雖然顯示出誘人的前景，但也存在一些問題。 主要是靶向治療是一個長期、緩慢的治療過程，見效比較慢，藥物在肝 、 腎臟的 網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)沉積是否會引起患者中毒或栓塞，對其臨床試用的給藥有效性進(jìn)行合理的評價尚存在一定的困難，因此其臨床用藥的最佳劑量和用藥時間還存在一定的問題。隨著臨床試驗(yàn)的開展，出現(xiàn)了一些對靶向藥物耐藥性的報道，同時不同的靶向藥物對 者療效差異較大，用藥方案應(yīng)根據(jù)患者 變的不同位點(diǎn)或表達(dá)水平等制定，藥物選擇的適應(yīng)癥較強(qiáng)，臨床普及困難。 于其獨(dú)特的分子病因?qū)W基礎(chǔ)， 已 顯示出生物治療的廣闊前景。雖然目前多數(shù)研究還局限于體外細(xì)胞培養(yǎng)和動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，即使應(yīng)用于臨床治療規(guī)模也較小，但隨著分子生物學(xué) 的進(jìn)展和基因工程技術(shù)的完善，生物治療在 綜合治療中必將發(fā)揮更加重要的作用。但在實(shí)際應(yīng)用中，仍存在一些問題有待解決。 狀旁腺素（ 狀旁腺素的特點(diǎn)及定位 甲狀旁腺素是甲狀旁腺主細(xì)胞分泌的堿性單鏈多肽類激素，由 84個氨基酸組成 ，其 15個氨基酸殘基的前甲狀旁腺激素原，分泌過程中它首先在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的膜周質(zhì)腔中被信號肽酶切除 5個氨基酸的信號肽部分成為甲狀旁腺激素原，然后在高爾基體中被切掉 6個氨基酸的前體部分成為 84肽成熟激素 28。 84肽在體內(nèi)可降解成 活性片斷，由于 有 此， 端 29。以后這一前身物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)裂解成為含 90個氨基酸的第二前身物質(zhì)甲狀旁腺激素原，后者進(jìn)而在細(xì)胞內(nèi)裂解成為含 84個氨基酸的多肽，即 在血鈣降低的情況下釋放到血液中。 酸，堿性氨基酸的含量比較豐富。各種哺乳動物，如牛、豬、狗、鼠 以及禽類如雞等的 魚類的 垂體中也發(fā)現(xiàn)有 6 該基因定位于人第 12號染色體 5744，基因全長133123屬于人類，是人類大規(guī)模測序所獲得的具有完整 過對非冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的檢索，發(fā)現(xiàn)該蛋白在多個物種中具有高相似性的蛋白質(zhì)，其相似性分別為獼猴 穴兔 豬 馬 牛 大鼠 小鼠 原雞 斑馬魚 30。 理化性質(zhì)和親水性預(yù)測結(jié)果表明該蛋 白預(yù)測分子量為 論等電點(diǎn)為 堿性蛋白質(zhì)。 狀旁腺素的生理功能與作用原理 在哺乳動物中， 節(jié)鈣和磷的代謝，促使血鈣水平升高，血磷水平下降。 血鈣時， 合于腎和骨靶細(xì)胞上的 通過對靶細(xì)胞直接或間接的作用幫助血鈣維持在一定范圍。在腎臟中， 1- 羥化酶的活性，增加腸 內(nèi) 1， 253介導(dǎo)的鈣吸收；在骨骼中， 能通過直接作用于成骨細(xì)胞和間接作用于破骨細(xì)胞維持鈣代謝的長期穩(wěn)定。另外， 可通過抑制腎近端小管和遠(yuǎn)端小管對磷的重吸收 使血磷濃度維持在正常范圍 31 。 生物化學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究表明， 蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。其中參與磷脂酶 蛋白激酶 C (號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的是高親和度受體，而參與腺苷酸環(huán)化酶 (號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的是低親和度受體 。 a+換，是 白激酶 刺激新的葡萄糖生成和鈣三元醇的合成、抑制 K+目前尚未找到其作用的靶蛋白。另外， 介導(dǎo)的雙重作用 (增加上皮電位差和打開細(xì)胞表面的離子通道 )刺激對二價陽離子的重吸收；而 括頂膜鈣通道嵌入膜中、基側(cè)氯通道打開引起細(xì)胞超極化以及調(diào)節(jié) 種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑都參與該過程，但其靶分子尚未確證 32。 一般認(rèn)為 端，但是其 端的另一些生物活性可能是必需的。另有研究表明， 9別是 69和 84位的氨基酸，對 端和成骨細(xì)胞的特異性結(jié)合起到很重要的作用 33。 端，其 1留了 7 受體結(jié)合和生物 活性所需結(jié)構(gòu)為 端的兩個 端 15端的高親和力作用 (這對受體的結(jié)合起決定性作用 )以及 端 1這與受體的激活密切相關(guān) )，而 159位的氨基酸殘基可影響 端與受體近膜區(qū)的結(jié)合能力 34 。 26、 27位的 參與受體結(jié)合，對活性不重要，因此分別對其進(jìn)行生物素化 (和生物素結(jié)合 )，不影響活性；但同時 生物素化后，活性丟失，可能是因?yàn)榈入婞c(diǎn)、疏水性和空間結(jié)構(gòu)均發(fā)生了改變 35。20位 它被編碼氨基酸取代，則肽的腺苷酸環(huán)化酶 (活作用失去；而當(dāng)它被非編碼氨基酸取代后，肽的 0。特異的 水側(cè)鏈、 0位 37。另外， 15位 3位 使肽以適當(dāng)?shù)目臻g構(gòu)象與受體結(jié)合 31。 狀旁腺素受體 在 胞上目前發(fā)現(xiàn)三種甲狀旁腺激素受體，其中可與 可通過 經(jīng) 和 高細(xì)胞內(nèi) 濃度，從而發(fā)揮作用。 目前研究較多的 1% 的同源性，能選擇性結(jié)合 不能結(jié)合 31，這主要與相關(guān)蛋白的 5位 36。目前，對 對 個跨膜螺旋區(qū)和一個由 150個氨基酸組成的巨大的 外區(qū)含 6個保守的 有一些保守氨基酸分散于 膜螺旋和連接跨膜螺旋的環(huán)中 31。 端 端發(fā)生結(jié)合，稱為 端 為 中 蛋白的活化相關(guān) 38。 降鈣素受體的特點(diǎn)及分布 體內(nèi)鈣代謝雖然受多種激素的影響，但是調(diào)節(jié)細(xì)胞外液中鈣離子濃度的兩種 8 主要激素是 鈣素是由甲狀腺濾泡旁細(xì)胞分泌的一種肽類激素，可以降低血鈣水平 39。降鈣素與 其作用正好相反。從表面看，這兩種激素起拮抗作用，但實(shí)質(zhì)上是相輔相成的，也正是這兩種激素的共同作用，維持著血鈣 水平的相對恒定。調(diào)節(jié)降鈣素分泌的主要生理因素也是血漿 度。當(dāng)血漿 度高于 9毫克 /100毫升水平時，降鈣素的分泌隨血鈣濃度增加而增加。當(dāng)血鈣濃度降至 9毫克 /100毫升水平以下時，血中降鈣素水平不可測出 40?？梢?，在血鈣的生理濃度范圍內(nèi)，血鈣水平同時受到 而使調(diào)節(jié)更為精細(xì) 41。 蛋白耦聯(lián)的細(xì)胞膜受體超家族，這類受體的共同特點(diǎn)是氨基酸的組成相似，有 7個跨膜結(jié)構(gòu)，受體 中 8個半胱氨酸可能對維持受體的空 間構(gòu)象有關(guān) 42。 胞膜，分子量為 85000氨基酸序列形成 7個跨膜區(qū)及連接這些跨膜區(qū)的 4個細(xì)胞外功能區(qū)（ 4個細(xì)胞內(nèi)功能區(qū)（ 其氨基端位于細(xì)胞外，羧基端位于細(xì)胞內(nèi)，已經(jīng)證明氨基端功能區(qū)和 3、第 6跨膜區(qū)是受體激活的關(guān)鍵部位 41。人 號和第 9號染色體。 抑制 K+波狀緣的伸展活動受限，導(dǎo)致 外還可抑制碳酸酐酶，減少酸的 分泌； 而增強(qiáng) 發(fā)現(xiàn) 逃逸 ”現(xiàn)象后，人們曾把這一現(xiàn)象歸咎于繼發(fā)性甲旁抗和 42。但后來的研究發(fā)現(xiàn)， 體外培養(yǎng)的 逃逸 ”現(xiàn)象，因而推測蛋白激酶 體的磷酸化可能降低它與 降低 內(nèi)所有調(diào)節(jié) 要是全身性的激素調(diào)節(jié)，如對體內(nèi)鈣平衡的激素，包括甲狀旁腺素、活性 維生素激素等的調(diào)節(jié) 43。它們與 們主要是通過影響 T，因此對 甲狀旁腺素受體單抗 在 中可與 可通過 經(jīng) 和 高細(xì)胞內(nèi) 濃度，從而發(fā)揮作用。 9 抗甲狀旁腺素受體的抗體是 性是由 要通過以下途徑來調(diào)控甲狀腺濾泡旁細(xì)胞的生理反應(yīng) ： l）腺苷酸環(huán)化酶 (徑 ： 體 G 蛋白 調(diào)控基因表達(dá)，該途徑主要調(diào)節(jié)一些蛋白的表達(dá)及轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而調(diào)控甲狀腺激素的分泌和甲狀旁腺細(xì)胞的增殖。 2）三磷酸肌醇 (徑 ： 體 G 蛋白 磷脂酶 C磷脂酰肌醇二磷酸 ( 二?；视停?+即此時細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生兩個第二信使， 過與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的 道結(jié)合，使 放入細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，升高的度刺激 釋放，從而促進(jìn)甲狀腺激素的合成。 體與甲狀腺髓樣癌細(xì)胞株 狀腺髓樣癌細(xì)胞株的研究進(jìn)展 T 細(xì)胞株的建立 及特征 甲狀腺髓樣癌細(xì)胞株是 1981 年由 建立，其來自一位 77 歲白人女性的穿刺活檢標(biāo)本，取自甲狀腺髓樣癌組織，通過單細(xì)胞分離培養(yǎng)的方法，傳 代培養(yǎng) 24，由單細(xì)胞增殖形成的細(xì)胞群，也叫甲狀腺導(dǎo)管癌細(xì)胞株（ 胞株）。 胞可持續(xù)產(chǎn)生高水平的降鈣素和癌胚抗原 （ 細(xì)胞形狀大多為梭形，少數(shù)為不規(guī)則形。此細(xì)胞培養(yǎng)于含 15%胎牛血清的 養(yǎng)基中，于 37 養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 胞株是高度分化的 胞株中的一種，代表了少數(shù)幾個人類上皮細(xì)胞中能分泌多肽激素的一類細(xì)胞，這些細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的特征包括成熟的糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、顯著的高爾基體和一些數(shù)量可觀的分泌顆粒。通過免疫組織化學(xué)已證實(shí) 了在 胞中有許多的激素，降鈣素（ 降鈣素基因相關(guān)肽（ 它們是相同基因的產(chǎn)物，但不同的是在 因轉(zhuǎn)錄時的 選擇性剪切中 40。 胞不但分泌一些激素：如 神經(jīng)降壓素 、 腦啡肽 、 泌素釋放肽 (、 5且也可產(chǎn)生嗜鉻粒蛋白家族的功能蛋白，如突觸小泡蛋白、 結(jié)合蛋白和酪氨酸羥化酶等 45。 胞株與構(gòu)建的其它的甲狀腺髓樣癌細(xì)胞株相比，是目前為止最可信賴的人類濾泡旁細(xì)胞的模型系統(tǒng)。 1932 年， 一次提出了甲狀腺濾泡旁細(xì)胞 ，命名為哺乳動物甲狀腺特定地內(nèi)分泌非濾泡細(xì)胞 46。 1967 年 過免疫熒光法成功地證實(shí)了在濾泡旁細(xì)胞中存在著降鈣素，促進(jìn)了對甲狀腺濾泡旁細(xì)胞的研究。同時也提出它們是由甲狀腺濾泡旁細(xì)胞特異性分泌的，因?yàn)樗鼈兤鹪从邛w后體， 10 為它們應(yīng)該被叫做 C 細(xì)胞。因此， C 細(xì)胞和濾泡旁細(xì)胞被用來描述相同類型的，能分泌降鈣素的甲狀腺細(xì)胞。目前在文獻(xiàn)中這兩種名稱通用。甲狀腺髓樣癌（ 源于濾泡旁細(xì)胞，是由濾泡旁 成的。 1959 年以前， 未分化型甲狀腺癌沒有區(qū)別開來。因?yàn)樗徽剂怂屑谞钕侔┑?10%，且只發(fā)生在年輕個體中。大約 25%的 多發(fā)性內(nèi)分泌腫瘤綜合癥（ 關(guān)。研究發(fā)現(xiàn) 產(chǎn)生降鈣素，認(rèn)為其為 標(biāo)志物。濾泡旁細(xì)胞產(chǎn)生的降鈣素和其它的典型物質(zhì)在早期的 斷中是很有價值的，尤其是在五肽促胃酸激素刺激后篩查潛在的 族成員中。一些濾泡旁細(xì)胞非典型的物質(zhì)如 神經(jīng)降壓素 、腦啡肽 、 5前已建成了起源于 不同的細(xì)胞株。 1974 年， 第一次描述了 保持了原始腫瘤的一些形態(tài)學(xué)和功能特征 46。另一個起源于鼠 細(xì)胞株是 44胞株，它是在 1987 年由 描述的，此細(xì)胞可合成和分泌神經(jīng)降壓素，降鈣素，胃泌素釋放肽。 1983 年， 將鼠 胞株成功地用于濾泡旁細(xì)胞的模式系統(tǒng)。此細(xì)胞表達(dá)降鈣素，降鈣素基因相關(guān)肽和縮膽囊肽。 起源于人甲狀腺髓樣癌的 胞株是目前的最穩(wěn)定的細(xì)胞株。 胞與正常的甲狀腺濾泡細(xì)胞相比，表達(dá)較低量的分泌顆粒。雖然在人類和大多數(shù)哺乳動物包括 小鼠中，發(fā)現(xiàn) 胞可以產(chǎn)生一些激素和功能蛋白標(biāo)志物，但第一次免疫組化證明的一些激素為僅為 5 余的激素的 通過細(xì)胞雜交化學(xué)法檢測到的，間接的證實(shí)了其的存在 47。通過放射免疫法測定培養(yǎng)基中的激素，或通過免疫細(xì)胞化學(xué)法研究培養(yǎng)的 胞，已證實(shí)在細(xì)胞中存在的蛋白與分泌顆粒有關(guān)。這些蛋白包括嗜咯粒蛋白 A，突觸小泡蛋白。一個非常重要的發(fā)現(xiàn)是在 胞中檢測到了 經(jīng)元特異性烯醇化酶）， 含量 隨著 泌物而改變，內(nèi)染色的強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi) 量相反，與培養(yǎng)基中 水平有直接的關(guān)系。因此， 可能被用來估計 胞的功能特征。 1985 年 過免疫細(xì)胞化學(xué)法在研究髓樣癌時明確了 細(xì)胞骨架蛋白的重要特征。 1995 年在酶參與的氨基酸生成 實(shí)驗(yàn) 中，在 胞中發(fā)現(xiàn)了胸腺肽縮化酶。在胞液 ，發(fā)現(xiàn)了鈣結(jié)合蛋白和酪氨酸羥化酶。一些標(biāo)志蛋白已經(jīng)在胞液和細(xì)胞骨架中檢測到，代表性的分別有 胞角蛋白。 胞株生物學(xué)特性的研究 胞分 泌物的調(diào)節(jié)機(jī)制是其生物學(xué)特性研究的熱點(diǎn)。通過對 胞超微結(jié)構(gòu)觀察和細(xì)胞免疫化學(xué)法染色發(fā)現(xiàn)： 胞與正常的甲狀腺濾泡旁細(xì)胞和大多數(shù)髓樣癌細(xì)胞很相似，所以 用此細(xì)胞株來研究甲狀腺髓樣癌細(xì)胞的分泌和調(diào) 11 節(jié)功能以及用于臨床研究較為合適。大多數(shù)研究 胞分泌功能的調(diào)節(jié)涉及到 過雜交細(xì)胞化學(xué)法和免疫超微研究證實(shí) 胞可以產(chǎn)生兩種 兩種激素（ 決定是產(chǎn)生是 由 錄為 的選擇性剪切決定的。目前選擇 性剪切的機(jī)制還沒有完全澄清，此過程受包括激素在內(nèi)的若干因素的影響。在甲狀腺 C 細(xì)胞中， 主導(dǎo)地位，而 神經(jīng)組織中大量存在。然而，剪切決定不是絕對的，正常的甲狀腺 C 細(xì)胞除了可產(chǎn)生還可產(chǎn)生少量的 分泌的 培養(yǎng)的 胞的生長時期有關(guān)，分泌的最高期是在 胞生長的穩(wěn)定期，最低是在指數(shù)期 48,49。這些在培養(yǎng)的細(xì)胞中的變化有可能與 人的行為一致。通過細(xì)胞質(zhì) T 與 比率隨著 胞的增殖而變化。在 初期培養(yǎng)時， CT 水平很高， 水平相對較低，在早期的對數(shù)生長期， 水平成倍的增長，而 CT 水平變化很輕微，隨著細(xì)胞接近融合，CT 水平都增長，隨后， 水平在融合后大體上降低，而 CT 水平保持上升。通過放線菌素 D 阻止最初的轉(zhuǎn)錄表明，這些與增長有關(guān)的 率的可逆改變不是因?yàn)槎ㄐ缘淖兓?50。研究表明 胞可逆的改變 擇性剪切的模式是由于體外的生長條件， 所以在 胞快速增長時 CT 平低而平高 51。 1987 年 報道 1， 25減少 胞中 因的表達(dá)。這一發(fā)現(xiàn)于 1988 年由 小鼠的實(shí)驗(yàn)中證實(shí) 46。 1991 年， 過免疫細(xì)胞化學(xué)法在 胞的細(xì)胞核和細(xì)胞液中證實(shí)了 1， 25體的存在。他們發(fā)現(xiàn)當(dāng)將細(xì)胞培養(yǎng)于生理濃度或高 1， 25度時受體的水平增加。相似地，相同劑量的 1， 25制分泌，指出在 1， 25間存在著反饋調(diào)節(jié)。 由此推斷 1， 25用于 胞的調(diào)節(jié)機(jī)制為：鈣離子修飾 放，是以快速的方式通過濾泡旁細(xì)胞而沒有先影響 合成，因而在分泌過程中是直接的影響 46。 胞是研究甲狀腺髓樣癌最有代表性的細(xì)胞。在先前的研究中已證實(shí)生長激素抑制素獨(dú)特地結(jié)合在 胞的表面，這表明此激素的受體存在于 胞上。利用特殊的受體激動劑和抑制劑已經(jīng)證實(shí)在 胞表面至少存在著兩種類型的生長激素抑制素的受體。已有證實(shí)奧曲肽是一種生長激素抑制素的類似物，可抑制 胞的增殖，減少 細(xì)胞中的數(shù)量，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡與壞死 52。另有研究表明，奧曲肽也影響 胞 因的表達(dá)和選擇性 12 剪切，提高了 產(chǎn)量。此影響有可能是因?yàn)?胞攜帶著生長激素抑制素受體，可自己產(chǎn)生生長激素抑制素，而生長激素抑制素以自分泌的方式不但控制著細(xì)胞的增殖也控制著其自身的表達(dá) 53。也有人認(rèn)為 胞是良性 為它們有相同的生物學(xué)性能，其等同于體內(nèi)正常的 C 細(xì)胞 54。胃泌素不僅可以誘導(dǎo) 放 可促進(jìn) 胞中 因的轉(zhuǎn)錄，伴隨地嗜鉻粒 蛋白 A 表達(dá)被促胃泌素激活 55，表明 胞對研究促胃泌素和 分泌，基因活性和增殖效應(yīng)是一個新的靶點(diǎn)。 T 細(xì)胞株的研究展望 甲狀腺髓樣癌的發(fā)病率為 8%但死亡率遠(yuǎn)高于 10%。目前手術(shù)切除是唯一可選擇的根治方式，通過體外培養(yǎng) 胞而模擬 胞體內(nèi)的生存環(huán)境，給于一些藥物干預(yù)，通過生物學(xué)方法測定細(xì)胞的生長狀況，如增殖 、 凋亡 、壞死等，來預(yù)測藥物對 作用，為藥物開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。 2011 年在 研究了三種 酶在 26 個 者組織中的表達(dá)情況并且分析了 酶的抑制劑 胞的生長及腫瘤發(fā)生學(xué)的影響 56。此研究最后得出的結(jié)論是 以抑制 胞的生長及其的腫瘤發(fā)生學(xué)，在 治療方面有潛力。 一個很重要的特征是氨酸激酶原癌的轉(zhuǎn)變， 皮生長因子受體（ 血管內(nèi)皮生長因子受體激酶的 爭性抑制劑 57。 研究了人甲狀腺髓樣癌細(xì)胞株 作用機(jī)制， 表明 胞的增殖 58。通過 擾技術(shù)敲除單個受體表明 賴于殖，在給 胞給于 理的情況下，再給于 制劑使細(xì)胞增殖。這表明在 胞中， 靶向治療藥物 一個關(guān)鍵點(diǎn)。對 胞株基因研究的結(jié)果對人甲狀腺髓樣癌的治療有重大意義，了解不同原癌基因在人類惡性腫瘤中扮演的重要角色，為 基 因的治療提供視角。最近 胞被用 來研究 癌基因的下調(diào)表 達(dá)， 癌基因在人類腫瘤中大量的表達(dá)。 胞株是用來研究 位基因突變的生物活性和生物化學(xué)性能的合適模型，隨著（ 2導(dǎo)的 胞分化可導(dǎo)致 著對 胞結(jié)構(gòu)和功能的研究繼續(xù)，有越來越多的材料可用于支持這個理論：研究人類濾泡旁細(xì)胞這些獨(dú)特的細(xì)胞株仍是最可信賴的模型系統(tǒng)。 體對 胞株的作用機(jī)制 促甲狀腺激素（ 是腺垂體分泌的促進(jìn)甲狀腺生長的激素，主要作用于甲狀腺。 甲狀腺濾泡細(xì)胞 13 的特異 受體結(jié)合促進(jìn)甲狀腺激素的釋放，促進(jìn) 合成 59。 方面受下丘腦分泌的促甲狀腺激素釋放激素（ 促進(jìn)性影響，另一方面又受到甲狀腺分泌的 饋性的抑制性影響。 因位于染色體 14度為 6060包括 10 個外顯子和 9 個內(nèi)含子，第 1顯子編碼 N 端鏈的膜外區(qū)蛋白，第 10 外顯子編碼跨膜區(qū)和膜內(nèi)區(qū)蛋白 62,63。長 2470碼 764 個氨基酸，分子量為 85糖鏈后為 100白屬 G 蛋白偶聯(lián)受體超家族成員，為一大分子糖蛋白。 甲狀腺癌的內(nèi)分泌治療是基于反饋抑制促甲狀腺激素的分泌。甲狀腺髓樣癌起源于甲狀腺濾泡旁 C 細(xì)胞，不受 影響，因此傳統(tǒng)的促甲狀腺激素抑制療法對 者無效。甲狀腺髓樣癌分泌降鈣素，而患者的血鈣濃度在正常范圍內(nèi)，其主要原因與甲狀旁腺素的調(diào)節(jié)有關(guān)，是否可以推測甲狀旁腺素在甲狀腺髓樣癌中起調(diào)節(jié)作用。已有研究證實(shí) 以抑制某些細(xì)胞株的增殖，如骨和腎細(xì)胞，但對 胞是 否也有增殖作用目前還未報道。 體可與胞內(nèi)的 合，從而使細(xì)胞內(nèi) 含量增加，此實(shí)驗(yàn)中我們以甲狀腺髓樣癌細(xì)胞株（ 研究對象，模擬 內(nèi)的生長狀態(tài)，外源性的給予 體兩種藥物，檢測細(xì)胞的生長狀況，為基礎(chǔ)研究提供一系列的證據(jù)。 驗(yàn)的目的意義 （ 1） 通過研究 體在 胞中的作用，推測其對甲狀腺髓樣癌病變的影響，初步分析甲狀腺髓樣癌的激素調(diào)控機(jī)制。 （ 2） 為甲狀腺髓樣癌治療提供新的途徑，并對臨床藥物的開發(fā) 和甲狀腺髓樣癌研究提供平臺。 （ 3）目前國內(nèi)外對此方面的報道比較少，因此，探討 體對甲狀腺髓樣癌細(xì)胞調(diào)空機(jī)制有非常重要的價值和臨床意義。 14 第二章 材料與方法 究對象 甲狀腺髓樣癌細(xì)胞株（ 胞株），此細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，來自一 位 77 歲白人女性的穿刺活檢標(biāo)本， 胞持續(xù)產(chǎn)生高水平的降鈣素和 癌胚抗原 。在更換培養(yǎng)基后 24 小時和 72 小時在培養(yǎng)基中檢測到的免疫活性的降血鈣素濃度分別為 3900萬細(xì)胞和 7700萬細(xì)胞。 72 小時后 累濃 度超過 27萬細(xì)胞。 要試劑及器材 主要試劑包括 養(yǎng)基（ 15%，美國 司） 、 胎牛血清（ 司） 、胰蛋白酶（ 1%） 、 、 青霉素（ 500U/、 鏈霉素（ 500U/、 谷氨酰胺（ ） 、 丙酮酸鈉（ ） 、 、 、 細(xì)胞 凋亡 檢測試劑盒（ 、 、一鏈 成試劑盒（上海生工 ） 、 步法 劑盒（ 。 主要設(shè)備包括 ，流式細(xì)胞儀（美國 倒置相差顯微鏡（ 艾科浦超純水系統(tǒng)（ 超凈工作臺， 養(yǎng)箱，立式壓力蒸汽滅菌器，低俗大容量多管離心機(jī)（ 液氮罐， 電腦電熱恒水槽，恒溫干燥箱，電熱恒溫培養(yǎng)箱均由國內(nèi)公司生產(chǎn)。 表 1 測的引物序列 - 3 - 3 398 - 413 15 胞的培養(yǎng) 器的清洗及消毒 使用的培養(yǎng)器皿，要嚴(yán)格進(jìn)行清洗，以去除所帶有的灰塵、鉛、砷等物質(zhì)，并消除其弱堿性，降低各種有害物質(zhì)對細(xì)胞的損害。先用自來水加洗衣粉浸泡過夜，浸泡后用軟毛刷進(jìn)行刷洗，刷洗干凈后置于 烘箱烘干，然后浸入酸中過夜，酸液具有很強(qiáng)的腐蝕作用，操作過程中要戴防護(hù)用具。浸酸后的玻璃器皿先用自來水充分沖洗，至少沖洗 10 次，直至沒有任何酸浸液殘跡，然后依次用一蒸水，三蒸水漂洗 3 遍， 2 遍，要求干凈透明。置于烘箱烘干，用牛皮紙、棉布、鋁飯盒、玻璃或金屬制吸管筒、棉線繩等嚴(yán)格包裝好，以防止消毒滅菌后再次遭受污染，固體一般在 126高壓 30 分鐘。液體 121高壓 10 至 20 分鐘，將針頭插入膠塞使其透氣。 對于塑料瓶蓋或膠塞