【畢業(yè)學位論文】（Word原稿）鎳冶煉職工氧化損傷修復標志物的作用研究

蘭州大學碩士研究生學位論文 鎳冶煉職工氧化損傷修復標志物的作用研究 1 第一章 前 言 及其化合物的研究進展 鎳及其化合物是重要的工業(yè)有色冶金產(chǎn)品，但鎳生產(chǎn)過程中的一些鎳化合物具有一定毒性，有關(guān)流行病學調(diào)查和實驗室研究已證實某些鎳化合物可引起人類健康損害 1。 化性質(zhì) 的理化性質(zhì) 鎳，銀白色硬金屬。元素符號 鎳的原子序數(shù) 28， 原子量 對密度 熔點（ 1453 1） 。 沸點 2732 。不溶于水 ， 可溶于硝酸 ， 稍溶于鹽酸和硫酸。鎳的無機 化合物中氧化物和氫氧化物不溶或微溶于水 ， 其鹽類則易溶于水。 在 20時的密度為 熔點 (1453 )時液體鎳的密度為 500為 他鎳產(chǎn)品的密度（ g 別為：鑄鎳 丸 學純致密鎳 單位體積的鎳能吸收 體積的氫氣。鎳在大氣中不易生銹，能抵抗苛性堿的腐蝕。大氣實驗結(jié)果表明， 99%純度的鎳在 20 年內(nèi)不生銹痕，在空氣或氧氣中，鎳的電極位為 25時為 溶液中有少 量雜質(zhì)，尤其是有硫存在時，鎳即顯著鈍化。 在 20時鎳的比電阻為 10 鎳基合金雖然廣泛用于熱元件，但由于易氧化的原因純鎳實際上無此用途。低矯頑力為 的主要化合物及其性質(zhì) 在自然界里鎳存在氧化物、硫化物和砷化物三種基本形態(tài)。它的氧化物有三氧化二鎳（ 氧化亞鎳 (。 低溫時穩(wěn)定，待加熱到 400450時即離解為四氧化三鎳（ 當溫度進一步提高最終變成 可形成多種 兩價鎳鹽，如氧化亞鎳溶于鹽酸、硫酸、亞硫酸和硝酸等溶液中就會形成綠色的兩價鎳鹽。不穩(wěn)定的 常作為氧化劑，用于鎳電解液凈化除鈷（ 熔點為 16501660，易被碳或一氧化碳還原。同時它還具有氧化作用，可使 變成 可以形成穩(wěn)定的硫酸鹽。 蘭州大學碩士研究生學位論文 鎳冶煉職工氧化損傷修復標志物的作用研究 2 鎳的硫化物有硫化鎳（ 硫化鎳（ 硫化亞鎳（ 。 高溫下不穩(wěn)定，在中性和還原條件下受熱時離解： 3。在冶煉溫度下， 離解 壓比 ，但比 。 鎳的砷化物有二砷化三鎳（ 砷化鎳（ 自然界中為紅砷鎳礦，在中性條件下可解離： 3s。 鎳在 40壓下，可與一氧化碳（ 成羰基鎳 O)43，反應式為 ： i(+ 當溫度至 150316時，羰基鎳又分解為金屬鎳。 途及暴露機會 鎳及其化合物 (常見的工業(yè)毒物 ， 是人類在職業(yè)和環(huán)境中廣泛接觸的工業(yè)物質(zhì)之一 。同時鎳又是人體必需的生命元素 ,過量的鎳會對人體造成危害。隨著工業(yè)的發(fā)展 ， 鎳礦的開采和利用日益廣泛，職業(yè)性鎳所涉及的作業(yè)和生產(chǎn)達 30 余種，鎳及其化合物已成為制造業(yè)廣泛應用的原材料 ， 接觸鎳的工業(yè)有采礦、 選礦、 冶煉、 熔煉與精煉、合金制造、 化工、電鍍、石油提煉 ，染料及硬幣制造等。在生產(chǎn)過程中可接觸鎳粉塵和蒸氣。常接觸的鎳化合物有一氧化鎳（ 氧化鎳 ( 氫氧化鎳 （ H)2） 、氫氧化高鎳（ H)3）、硫酸鎳（ 7 氯化鎳 ( 硝酸鎳（ 6等。 謝 鎳及其化合物的粉塵不能經(jīng)皮膚吸收。鎳作業(yè)工人主要通過呼吸道吸收鎳。被機體吸收后的鎳及其化合物廣泛分布于各組織器官中，隨后可經(jīng)糞便、尿及汗液等排出體外。另外，吸收量與化合物的溶解度有關(guān)。鎳的可溶性化合物易于被機體吸收并很快排出體外，它通過血液轉(zhuǎn)運至腎 ,由尿排出；而對與鎳的不溶性化合物經(jīng)動物染毒后 ,其在組織中存留時間較長 ， 這可能是其對機體產(chǎn)生有害作用的原因之一。 性 鎳化合物經(jīng)口毒性低 ,金屬鎳毒性更低。大鼠經(jīng)口半數(shù)致死量（ ： 5 mg/化合物中羰基鎳 (無色透明液體，毒性最高，短期吸入高濃度羰基鎳可引起急性毒性，表現(xiàn)為呼吸系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)損害。鎳及其水溶性化合物具有致敏性，還有一定的鎳化合物具有潛在致癌性與遺傳毒性。 從事冶煉、焊接以及煅燒操作的人群可發(fā)生過敏性反應、肺癌、口腔癌等病變 2, 3。 煉鎳工人呼吸道癌（肺癌、鼻竇癌）發(fā)病率增高。動物實驗中鎳粉、硫蘭州大學碩士研究生學位論文 鎳冶煉職工氧化損傷修復標志物的作用研究 3 化鎳和碳酸鎳均能致癌 4, 5。長期接觸鎳鹽或鎳粉塵的工人，常有呼吸道刺激癥狀 甚至肺纖維化 和接觸性皮炎等。 皮疹發(fā)作期尿鎳含量可增高。 而在 鎳礦冶煉作業(yè)場所中可檢測到的多為可溶性鎳化合物，這些化合物 對于環(huán)境中的生物也有明顯的毒害作用，它們呈氣霧狀，顆粒小，易達肺部，以致肺癌為主；而難溶性鎳化合物呈粉塵狀，顆粒大，除致肺癌外，易滯留鼻腔致鼻咽癌。兩者可呈現(xiàn)聯(lián)合作用，致癌的危險性會加強。 床癥狀與處理 鎳皮炎也稱為 鎳癢癥 ，佩帶鍍鎳飾品、鍍鎳器具以及接觸金屬鎳粉和硫酸鎳等都可引起變應性皮炎。它的皮損表現(xiàn)與一般接觸性皮炎類似，但常伴奇癢。對鎳及其化合物高度敏感者，可產(chǎn)生呼吸道損害，如支氣管哮喘或肺嗜酸粒細胞浸潤癥 (合征 )， 可出現(xiàn)輕度咳嗽 ， 低熱、胸悶等癥狀，病灶可呈游走性 ，周圍血嗜酸粒細胞輕度增高 ， X 線表現(xiàn)為肺部有散在扇形陰影。大多在 2 4 周內(nèi)自行恢復正常。尚 可發(fā)生急性與亞急性肺炎。 對鎳高度敏感者，應脫離鎳作業(yè)。對于 鎳癢癥 可按一般變應性接觸性皮炎處理。鎳引起的呼吸道損害，應給予對癥治療。 毒機制 鎳進入機體后能夠抑制或激活一系列的酶 , 如抗氧化酶系統(tǒng)、精氨酸酶 , 羰化酶等 , 從而影響體內(nèi)的代謝 ,對人體產(chǎn)生毒害作用。鎳化合物被機體吸收以后 , 可以對先刺激神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生興奮，過后抑制和麻痹 6。 國外有關(guān)報道提示鎳及其化合物可以誘導氧化應激發(fā)生 ， 產(chǎn)生超氧陰離子自由基和脂質(zhì)過氧化，可擾亂機體內(nèi)多種抗氧化酶活力變化 ， 導致對機體造成氧化性損 傷，表觀遺傳學改變甚至引起細胞突變、腫瘤發(fā)生 7, 8。 化應激損傷 鎳是一種有效的環(huán)境致癌物，暴露于鎳可使腫瘤抑制基因的基因位點形成異染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，誘導腫瘤抑制基因的從頭甲基化。 鎳化合物中的某些物質(zhì)如羰基鎳、氧化鎳和硫酸鎳等是一類多器官毒物 。 國內(nèi)外有關(guān)報道 提示鎳及其化合物可誘導氧化應激發(fā)生 ， 產(chǎn)生超氧陰離子自由基和脂質(zhì)過氧化， 可擾亂機體內(nèi)多種抗氧化酶活力 ， 導致機體氧化損傷 ，甚至引起細胞突變、表觀遺傳學改變和腫瘤發(fā)生 7。 蘭州大學碩士研究生學位論文 鎳冶煉職工氧化損傷修復標志物的作用研究 4 化應激 氧化應激（ 指 機體或細胞的促氧化和抗氧化之間失平衡而致的機體損害反應 9，它一般由外源性或內(nèi)源性 (最常見的是活性氧 由基的產(chǎn)生和機體抗氧化體系的缺陷而引起。 許多學者從不同角度研究外源性化學毒物所致急性肺損傷 ， 研究結(jié)果提示 ， 氧化應激和脂質(zhì)過氧化反應在急性肺損傷發(fā)病機制中 可能占有重要地位。而 氧化應激水平的上升，使得機體內(nèi)氧化抗氧化系統(tǒng)失衡，引起生物大分子如 白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能改變，進而使細胞結(jié)構(gòu)和功能破壞，引發(fā)一系列疾病 10。 化損傷 由基 由于某種原因電子的成對性被破壞 ， 或由于共價鍵斷裂使外層軌道產(chǎn)生帶有不配對電子的任何離子或分子均是自由基 11。自由基具有順磁性、化學反應性高、作用半徑與半衰期短的特點?；钚匝踝杂苫?擊生物大分子會造成機體內(nèi)生物大分子氧化損傷。自由基一類是正常參與線粒體電子轉(zhuǎn)動過程的籠蔽的自由基；另一類是現(xiàn)在研究備受矚目的自由的非結(jié)合狀態(tài)自由基 12。 自由基的形成分為外源性和內(nèi)源性 13。 內(nèi)源性自由基主要是生物體新陳代謝自發(fā)產(chǎn)生地自由基，主要來自酶促和非酶促反應。引起外源性自由基產(chǎn)生的主要是能進行氧化 還原反應循環(huán)的物質(zhì)，特別是化學毒物作用，可能是自由基的主要來源。有許多化學物質(zhì)能夠引起組織或細胞 增加，主要通過兩種途徑：一是阻斷電子傳遞，增加阻斷位點上游的還原水平；二是通過氧化還原反應，使化學物還原為不穩(wěn)定的中間產(chǎn)物，最終形成 ，中間產(chǎn)物則再生為原化學物。在正常的生理情況下大約有組織總耗氧量的 2%用于 產(chǎn)生。 由基對機體的作用 在正常生理狀態(tài)下，自由基在體內(nèi)產(chǎn)生和清除達到平衡，從而使機體維持有利的生理性自由基含量。自由基的積極作用是需氧生物進行新陳代謝的必需因子，可以增 強肝臟解毒作用，提高機體免疫力，并參與生殖與胚胎發(fā)育過程 14, 15?，F(xiàn)已證明，自由基在需氧生物的內(nèi)分泌、循環(huán)、神經(jīng)等生理活動中作為信號傳導分子發(fā)揮功能，并在細胞穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)等活動中發(fā)揮重要作用 16。 一旦機體處于應激狀態(tài)或機體本身清除自由基的能力下降時，體內(nèi)自由基就會因不能被完全清除而累積過多，極易與其他物質(zhì)反應形成新自由基，使機體許多重要的生物大分子如 白質(zhì)發(fā)生結(jié)構(gòu)和功能改變，進而使細胞結(jié)構(gòu)和蘭州大學碩士研究生學位論文 鎳冶煉職工氧化損傷修復標志物的作用研究 5 功能被破壞，發(fā)生不可逆的氧化損傷導致機體病變。 自由基對機體的損傷作用主要表現(xiàn)在：（ 1）通過攻擊生物膜磷脂，產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化反應 17。（ 2）蛋白質(zhì)是自由基攻擊的重要靶分子。與蛋白質(zhì)功能相關(guān)的幾種氨基酸，如組氨酸、半胱氨酸等，對自由基特別敏感?，F(xiàn)已證實，自由基對蛋白質(zhì)的損傷要早于脂質(zhì)過氧化的發(fā)生 18。由于蛋白質(zhì)的降解和交聯(lián)，特別是蛋白巰基的氧化可引起酶活力的改變。而蛋白質(zhì)的氧化又使它對酶促和非酶促蛋白質(zhì)水解反應敏感，最終導致蛋白質(zhì)的破壞和病理性組織降解。（ 3）自由基攻擊 螺旋外側(cè)的嘌呤和嘧啶堿基，使得堿基被修飾和雙鏈斷裂 19。 可與核酸反應，形成不同類型的堿基修飾產(chǎn)物。其中，以八羥基脫氧鳥苷（ 8常見，且數(shù)量最多，所以 8經(jīng)作為反映 化損傷的重要指標。另一方面， 攻擊 子中的核糖，可能在核糖 點造成 裂。而自由基攻擊胸腺嘧啶堿基所致?lián)p害，經(jīng)修復酶的切除也會產(chǎn)生相似的 單鏈斷裂。 復酶也因受自由基攻擊而影響其功能，因此，自由基導致的 害嚴重時可直接造成細胞的死亡。（ 4）自由基可引起蛋白酶釋放，降低抗氧化酶活性。還可以使多糖斷裂，影響其功能發(fā)揮。（ 5）自由基可使轉(zhuǎn)錄因子活化后異位到細胞核，并與特殊基因的啟動子區(qū)結(jié)合從而誘導轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生大量細胞因子和炎癥介質(zhì)等參與器官損傷 20。 鎳化合物進入細胞后被溶解或者酸化，被轉(zhuǎn)化為鎳離子（ 。 入機體后產(chǎn)生自由基，包括活性氧自由基（ 活性氮自由基 ( 進一步發(fā)生細胞膜的脂質(zhì)過氧化，使細胞膜的功能受損，最終導致細胞損傷甚或死亡。有 研究表明， 1。 使堿基修飾和 致聚二磷酸腺苷（ 酸轉(zhuǎn)移酶的活化和蛋白 53（ 積累，從而導致細胞凋亡。 近年來國內(nèi)外學者研究證實，羰基鎳可 誘導氧化應激發(fā)生 ,產(chǎn)生 22。 有研究表明，巨噬細胞刺激因子和脂多糖（ 在的情況下，鎳可以使細胞產(chǎn)生 酸鎳是胎兒樹突狀細胞 23。 質(zhì)過氧化對機體的作用 脂質(zhì)過氧化（ 不飽和脂肪酸氧化降解的鏈反應過程，它可以將活性氧氧化作用放大化，使得少量的活性氧導致很多脂類過氧化產(chǎn)物的生成。它的過程 分三期 24：（ 1）啟動期：自由基與不飽和脂肪酸產(chǎn)生脂肪酸自由基。（ 2）生成期：反應中加入氧原子，生成過氧自由基或 些生成物會進一步分解為酮類、醛類和烷烴類物質(zhì)。（ 3）終止期：在 應中，不飽和脂 肪酸氧化蘭州大學碩士研究生學位論文 鎳冶煉職工氧化損傷修復標志物的作用研究 6 分解最終釋放出反映性醛類如丙二醛（ 體內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應的主要代謝產(chǎn)物，并且存在于生命活動物質(zhì) 代謝和能量代謝的整個過程 25，是 基的雙功能團化合物。當個體處于劇烈運動、過度腦力和體力勞動、炎癥和疾病等各種應激（或者緊張）狀態(tài)時，都會產(chǎn)生過量的 起細胞損傷的機制：（ 1）對生物膜的損傷 26： 產(chǎn)物和自由基一樣都能夠破壞生物膜的完整性，使生物膜功能發(fā)生改變， 導致細胞破壞， 從而引起一系列病理過程的發(fā)生，導致機體出現(xiàn)相應的病理改變 27。（ 2）對蛋白質(zhì)的損傷 28： 引起蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間的交聯(lián)致蛋白質(zhì)損傷。（ 3）對核酸的損傷 29： 子損傷，其基本反應過程與蛋白質(zhì)一樣，是在分子內(nèi)和分子間發(fā)生非酶促碳 可與 起損傷。 而 使細胞的生物膜功能受到持續(xù)性損傷，最終導致機體功能受損。它既是組織進一步損傷的原因，又是組織損傷的結(jié)果。 所以測定 接反映 機體內(nèi)細胞 受自由基攻擊的嚴重程度 30。機體內(nèi) 示受傷害機率越大。 鎳鹽不僅可以引起細胞膜 使終末產(chǎn)物丙二醛 (含量明顯升高 31, 32，而且在線粒體、微粒體 使 導致細胞走向程序性死亡 33。氯化鎳導致 改變與氯化鎳存在劑量反應關(guān)系。硫酸鎳可以 引起大鼠明顯的 2。 閆銘鋒等 34的研究也顯示，羰基鎳可誘發(fā)大鼠肺、肝等組織 起 在組織間存在差異。羰基鎳特有的脂溶性可能更容易引起細胞的通透性而加重機體的細胞發(fā)生氧化應激，從而引起氧化損傷。 由基的清除 自由基在人類的體內(nèi)維持著動態(tài)平衡，自由基生成與自由基清除的兩套系統(tǒng)相互制約。機體抗氧化系統(tǒng)通過三條途徑：消除自由基和活性氧避免引起脂質(zhì)過氧化；分解過氧化物，阻斷過氧化鏈；除去起催化作用的金屬離子。防御體系的各成分之間起到了協(xié)同，代償和依賴作用。自由基的清除系統(tǒng)主要包括酶類抗氧化系統(tǒng)和非酶類抗氧化系統(tǒng) 35。 機體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)主要由超氧化物歧化酶 (過氧化氫酶 (谷胱甘肽過氧化物酶 (過氧化物酶 (成。它們能將自由基轉(zhuǎn)化為低毒的或是能被體內(nèi)其它機制進一步消除的產(chǎn)物； 機體內(nèi)清除自由基的第蘭州大學碩士研究生學位論文 鎳冶煉職工氧化損傷修復標志物的作用研究 7 一道防線，它能有效控制體內(nèi) 量，避免組織與細胞受到過量 損傷36。鎳離子抑制體內(nèi)抗氧化酶的活性 ， 間接削弱細胞的抗氧化能力 ， 而機體抗氧化能力的降低會使體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧中間體不能及時消除，使機體遭到傷害。有研究顯示 ， 鎳可以引起淡水魚抗氧化物酶活力降低，并且腎臟的損傷大于脾臟 22。 37研究表明，過量的 入體內(nèi)可影響含鋅、含鎂等多種酶的活力及功能 ， 干擾組織器官代謝。 38研究顯示，大鼠鎳染毒后出現(xiàn)明顯的氧化損傷，表現(xiàn)為 顯降低。 抗氧化非酶系統(tǒng)包括抗壞血酸 (谷胱甘肽（ 維生素 E(類胡蘿卜素等。鎳與非酶類抗氧化系統(tǒng)中的物質(zhì)不是直接激活，而是當鎳對機體造成氧化損傷時，非酶類抗氧化系統(tǒng)對氧化損傷進行拮抗。 有較強的抗氧化性和抑制 腫瘤的作用。 細胞膜上存在的主要脂溶性抗氧化劑，能保護細胞膜防止脂質(zhì)過氧化。研究顯示，鎳可使肺巨噬細胞膜脂質(zhì)過氧化程度顯著增加，對細胞膜有損傷作用。 有明顯的抑制染鎳肺巨噬細胞膜脂質(zhì)過氧化作用，同時發(fā)現(xiàn) 通過提高抗氧化酶活性抑制 表達，減少活性氧及一氧化氮的產(chǎn)生，拮抗鎳對肺泡巨噬細胞的氧化損傷 39。有研究證明，維生素 E 可以通過增加 量而拮抗金屬誘導的毒性 40。 可通過影響41。研究非酶類抗氧化系統(tǒng)可以幫助我們干預和保護易感人群。 由基及 檢測方法 諸多研究證明自由基與很多疾病有關(guān)， 對自由基的研究也已成為熱點，如何有效、快速和靈敏的檢測自由基就尤為重要。因機體內(nèi)存在氧化與抗氧化平衡系統(tǒng)，所以我們可利用機體的各種抗氧化酶或氧化產(chǎn)物的水平來間接表示自由基水平?，F(xiàn)有檢測自由基的方法主要有化學發(fā)光法、高效液相色譜法、電子順磁共振法及分光光度法等 42。 本試驗采用分光光度法試劑盒測定超氧化物歧化酶（ 脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛（ 間接測定機體自由基水平， 含量也能間接反映機體氧化損傷程度。通過比色法，根據(jù)溶液的光密度（ 化值可計算出相應含量。 蘭州大學碩士研究生學位論文 鎳冶煉職工氧化損傷修復標志物的作用研究 8 觀遺傳學組蛋白甲基化修飾研究進展 觀遺傳學 表觀遺傳學 (要包括 基化、基因組印跡、染色質(zhì)重塑和X 染色體失活 43。它發(fā)生的不涉及 列改變，而是通過組蛋白修飾，非組蛋白的結(jié)合和染色質(zhì)重塑等去有序地調(diào)整基因表達。這些修飾在細胞增殖和個體發(fā)育過程中能通過細胞分裂穩(wěn)定地進行傳遞。它與人類的生長發(fā)育、疾病和衰老密切相關(guān)。 到目前為止表觀遺傳學涉及的組蛋白修飾發(fā)現(xiàn)至少 9 個類型：磷酸化、乙?；?糖基化、甲基化、泛素化修飾 (生物素化、 脯氨酸同分異構(gòu)化和去精氨酸化 (44。它們通過影響組蛋白 相互作用從而改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)。一種修飾的存在可以協(xié)同或拮抗同一組蛋白上另一修飾的存在 ， 但其發(fā)揮作用是通過多種修飾共同調(diào)節(jié)形成一個修飾的級聯(lián)。繁多的修飾類型及時間和空間上的組合與生物學功能的關(guān)系可以編譯出很多潛在的調(diào)控信息，形成了“組蛋白密碼” 45。 組蛋白氨基末端殘基的翻譯后修飾與染色體的重塑和功能狀態(tài)緊密相關(guān)，對染色體結(jié)構(gòu)和基因轉(zhuǎn)錄進行調(diào)控 ， 并且在決定細胞生長及致癌作用的過程中發(fā)揮著重要的作用 46，是目前表觀遺傳學研究領(lǐng)域的重要部分。研究表明 47組蛋白磷酸化就在有絲分裂、 傷修復、細胞死亡、 制和重組過程中發(fā)揮直接作用 。 組蛋白乙?；c基因轉(zhuǎn)錄的激活與抑制相關(guān)，乙?；せ罨蜣D(zhuǎn)錄，去乙?；种苹蜣D(zhuǎn)錄。而組蛋白甲基化修飾在基因活性調(diào)節(jié)中扮演關(guān)鍵角色。如組蛋白賴氨酸的甲基化在許多生物學過程中發(fā)揮了重要作用， 它們包括異染色質(zhì)的形成、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等 ， 而且它的紊亂可能導致癌變的發(fā)生。 蛋白甲基化與去甲基化的產(chǎn)生 蛋白甲基化的產(chǎn)生 組蛋白甲基化是在組蛋白 N 端賴氨酸或精氨酸殘基上，由組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶 ( 化發(fā)生的。 如 及 催化 生甲基化的酶。 精氨酸殘基甲基化是由精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶 (催化下發(fā)生單甲基化或者雙甲基化的過程。組蛋白賴氨酸殘基上可發(fā)生甲基化的共有 6 個位點，這些賴氨酸的氨基側(cè)鏈在不同特性的組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶 (的催化蘭州大學碩士研究生學位論文 鎳冶煉職工氧化損傷修復標志物的作用研究 9 下可發(fā)生單 (雙 (三甲基化 (48, 49。在 化的過程中同一 以催化組蛋白賴氨酸不同位點使其產(chǎn)生甲基化； 不同 催化同一位點 ， 使其產(chǎn)生不同程度的甲基化；在催化一種形式的賴氨酸甲基化時，多數(shù) 有產(chǎn)物和底物特異性。 由于甲基化位點的不同，組蛋白賴氨酸甲基化可以對轉(zhuǎn)錄起激活或抑制的作用 ,但是對某些生物學過程如 X 染色體失活 ， 甲基化作用于相同位點 ， 但也會因甲基化數(shù)目不同而致不同結(jié)果。如首個被發(fā)現(xiàn)的組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶 ( 白，這個家族包括人 變酵母 ( 能特異性地使組蛋 白 基化 50。 蛋白去甲基化的產(chǎn)生 組蛋白的甲基化作用開始人們認為是穩(wěn)定不可逆的，但 51發(fā)現(xiàn)去甲基化酶使組蛋白甲基化過程更具有動態(tài)性。特異性作用于組蛋白 點的去甲基化酶是賴氨酸特異性去甲基化酶 1(它是單胺氧化酶，能夠通過氨基氧化作用達到去除甲基的目的，并且它只作用于 者 對于 酰精氨酸去亞胺酶 4(， 組蛋白精氨酸去甲基化酶，它能去除精氨酸的單甲基化，而對雙甲基化無效 52。它的去甲基化過程是使精氨酸轉(zhuǎn)變成瓜氨酸，精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶失去作用位點而實現(xiàn)的。 蛋白甲基化的作用 在表觀遺傳調(diào)控中起關(guān)鍵作用的是組蛋白賴氨酸甲基化。組 蛋白 賴氨酸第 4 位點（ 第 9 位點（ 第 27 位點（ 第 36 位點（ 第 79 位點（ 組蛋白 賴氨酸第 20 位點（ 可被甲基化。組蛋白間的化學修飾存在順式或反式作用，它們互相協(xié)同或者拮抗從而產(chǎn)生不同的基因調(diào)控效果 53。組蛋白 甲基化與基因失活相關(guān) ； 組蛋白 甲基化與基因激活相關(guān) ; 組蛋白 甲基化與 X 染色體失活、同源盒基因沉默、基因印記等基因沉默現(xiàn)象有關(guān) ； 組蛋白 基化與遏制基因失活和 復有關(guān)。與此同時 , 組蛋白的去甲基化與甲基化的競爭作用也受到更為廣泛的關(guān)注。 3基化 基化與基因激活相關(guān)。它不同程度的甲基化和在不同生物體內(nèi)的分布情況共同表明 ， 富集于活性轉(zhuǎn)錄基因。這兩種程度的蘭州大學碩士研究生學位論文 鎳冶煉職工氧化損傷修復標志物的作用研究 10 甲基化并不會完全一致的出現(xiàn)在同一地方 ， 布在活性轉(zhuǎn)錄基因主要部分 ， 而 限分布在這些基因的 5端 54。組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶都含有 構(gòu)域，而方式與 特異磷酸化形式的 聚酶有關(guān) 55。 3基化 組蛋白 類參與 , 3具有組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶活性 56； 39a， 參與體內(nèi) 57。 基化使得基因沉默的關(guān)鍵可能就是 在一些細胞系中 ， 基因（ 構(gòu)體聚集在大量活性基因的編碼區(qū)。 基化會因發(fā)生區(qū)域的不同如在編碼區(qū)還是啟動子而起到不同的功能 58。 基化是通過抑制 合酶 結(jié)合到染色質(zhì)上以及與其他表觀遺傳學修飾酶產(chǎn)生協(xié)同作用來發(fā)揮生物學功能。 蛋白甲基化與染色質(zhì) 鎳化合物在 1990年就已經(jīng)被國際癌癥研究機構(gòu) (為確定的人類致癌物 59。目前有關(guān)鎳化合物致癌機制的研究認為 ， 鎳化合物致癌的關(guān)鍵是 細胞染色質(zhì)的作用 60， 染色質(zhì)結(jié)合后 ， 可直接或間接引起染色體畸變損傷 ， 從而導致細胞染色體丟失或斷裂。 染色質(zhì)是染色體在細胞周期的間期 網(wǎng)狀或斑塊狀不定形物質(zhì)。它的基本化學成分為脫氧核糖核酸 核蛋白 ，是由 組蛋白 、非組蛋白、染色質(zhì)（ 1色深。以濃集狀態(tài)存在；常染色質(zhì)（ 色較淺且均勻，以分散狀態(tài)存在。 性染色質(zhì) 與性染色體有關(guān)，稱 染色質(zhì) 。在 度致密的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)極大地妨礙了 核生物細胞中通過組蛋白的共價修飾和 們改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)，對 復進程起關(guān)鍵的調(diào)控作用。研究表明，組蛋白的磷酸化、乙?；?、甲基化和泛素化等修飾在 修復過程中起到重要的調(diào)節(jié)蘭州大學碩士研究生學位論文 鎳冶煉職工氧化損傷修復標志物的作用研究 11 作用 61。如在染色質(zhì)上的任何一個部位 甲基化都可 以發(fā)生，但在 生損傷時，甲基化只在損傷位點周圍出現(xiàn)，其他位點不發(fā)生 62。在整個基因組都會發(fā)生這種 中也包括異染色質(zhì)區(qū)域 63，它的進行可以維持整個基因組的穩(wěn)定性。人類腫瘤的形成機制目前還不清楚，但是表觀遺傳學信息的改變是其重要因素之一。 染色質(zhì)蛋白 1 與組蛋白甲基化 異染色質(zhì)蛋白 1 (， 人類細胞中的主要生物學功能是維持染色體結(jié)構(gòu)的完整 ， 參與異染色質(zhì)形成并調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄。 種 亞型。在異染色質(zhì)區(qū)分布的主要是 而在常染色質(zhì)和異染色質(zhì)區(qū)都有分布的是 3 從而使 64?；揎椏赡苁?當甲基化酶 會使得 因啟動子區(qū) 水平降低 ， 結(jié)合在該區(qū)的 量也隨之減少。從而使 這些區(qū)域的招募降低 ， 基化水平也會隨之下調(diào) ， 因得以表達 65。 基化修飾通常與基因轉(zhuǎn)錄抑制及異染色質(zhì)形成有關(guān)。蛋白)， )可以與甲基化的 50發(fā)現(xiàn)， 3甲基化使其不受去甲基化酶攻擊，而 甲基化也是 異性結(jié)合位點。該位點即可發(fā)生甲基化，也可發(fā)生乙?；母偁幮孕揎椩诰S持轉(zhuǎn)錄抑制時可以在常染色質(zhì)與異染色質(zhì)之間形成精密調(diào)控的生物學過程。異的結(jié)合 后 ， 募集 使附近區(qū)域的組蛋白 點甲基化。這些位點甲基化修飾后又可招募 使得經(jīng)甲基化修飾的 蟲體內(nèi) 缺失會使其對 電離輻射的敏感度增加，所以 能在 傷識別及修復過程中也起著重要作用 66。 染色質(zhì)域解旋酶 合蛋白 1（ 組蛋白甲基化 個刺激核小體的 個串聯(lián)的蘭州大學碩士研究生學位論文 鎳冶煉職工氧化損傷修復標志物的作用研究 12 具有染色質(zhì)修飾功能的區(qū) (被認為能夠介導甲基化地賴氨酸與 究發(fā)現(xiàn)， 且它還是一個染色體裝配因子，與轉(zhuǎn)錄的延伸和終止有關(guān) 67, 68。人的 可以與3在數(shù)量上相等結(jié)合。當 蛋白甲基化與相關(guān)指標的檢測方法 組蛋白可以在很多位點發(fā)生修飾，并且這些修飾與基因調(diào)控和疾病的發(fā)生存在緊密的聯(lián)系。目前利用抗體以及質(zhì)譜的手段可以檢測組蛋白氨基酸殘基發(fā)生的修飾 61?，F(xiàn)有檢測組蛋白甲基化修飾的方法主要有染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)（ 術(shù)，也稱結(jié)合位點分析法，是研究體內(nèi)蛋白質(zhì)與 互作用的有力工具。通過與 微陳列芯片（ 測序（ 技術(shù)的結(jié)合，可實現(xiàn)活細胞內(nèi)特定蛋白與特異性基因序列結(jié)合的研究。隨著測定技術(shù)的不斷創(chuàng)新和完善，目前酶聯(lián)免疫吸附（ 定組蛋白甲基化的方法也日趨完善和穩(wěn)定 69。 本試驗采用 劑盒測定組蛋白 過比色法，根據(jù)溶液的光密度（ 化值可計算出相應含量。 究目的與意義 鎳 化合物是重要的工業(yè)有色冶金產(chǎn)品，隨著工業(yè)化進程加快和社會進步，鎳的應用范圍日益廣泛。但鎳生產(chǎn)過程中的一些鎳化合物具有一定毒性，從事冶煉、焊接以及煅燒操作的人群可發(fā)生過敏性反應、肺 癌、 鼻咽癌、 口腔癌等病變 2, 3。國外有關(guān)報道 提示鎳及其化合物可以誘導氧化應激發(fā)生 ， 產(chǎn)生超氧陰離子自由基和脂質(zhì)過氧化， 可擾亂機體內(nèi)多種抗氧化酶活力變化 ， 導致對機體造成氧化性損傷 ，甚至引起細胞突變、腫瘤發(fā)生。 然而鎳及其化合物致癌的細胞與分子機制 ，目前并不十分清楚。 為了進一步了解鎳及其化合物氧化應激損傷生物標志物，以及探索 機體作用導致腫瘤的原因， 探討 鎳職業(yè)接觸人群損傷的細胞與分子機制是本實驗關(guān)注與研究的 重點。 本課題擬通過建立鎳職業(yè)人群隊列及健康預警模型，找出檢測鎳暴露人群靈敏的生物標志物及其與某些生化指標之間的關(guān)聯(lián) ， 綜合評價鎳化合物暴露職業(yè)接觸人群不同工齡段的時間效應關(guān)系，為鎳冶煉職工早期健康損傷生物標志物的篩蘭州大學碩士研究生學位論文 鎳冶煉職工氧化損傷修復標志物的作用研究 13 選提供科學依據(jù)，并探討腫瘤發(fā)病的分子機制。 蘭州大學碩士研究生學位論文 鎳冶煉職工氧化損傷修復標志物的作用研究 14 驗技術(shù)路線 流行病學調(diào)查 生化檢測指標 職工健康體檢 氧化 損傷修復指標檢測 暴露時間效應分析 損傷修復的交互作用分析 職業(yè)人群人口學、生活行為因素分布特征 生化指標分布、腫瘤標志物分布資料 損傷修復指標分布資料 確定職業(yè)暴露早期損傷可能的早期預警生物標志物 提供科學合理的預防保健措施維護職工健康 3職業(yè)人群體檢職工 腫瘤標志物指標 損傷修復與其他指標關(guān)聯(lián)分析 鎳冶煉職工組 機關(guān)職工組 整理分析 質(zhì)量控制 質(zhì)量控制 蘭州大學碩士研究生學位論文 鎳冶煉職工氧化損傷修復標志物的作用研究 15 第二章 鎳冶煉職工暴露時間對氧化損傷標志物的影響 象與方法 查收集的目標人群 本次研究對 象總體為 2011 年 6 月至 2012 年 1 月，在金川公司職工醫(yī)院體檢中心接受健康體檢和流行病學調(diào)查表格資料收集的 12,388 名金川公司在職職工，其中男性 8,434 名，女性 3,954 名。 冶煉職工 中 暴 露 的抽樣 方法 金川集團股份有限公司鎳職業(yè)暴露人群二級單位整體分布狀況 表 2金川集團股份有限公司二級單位分布狀況 二級單位 調(diào)查人數(shù) 百分比（ %） 冶煉廠 3649 應分公司 347 煉廠 3298 動化工程公司 338 運分公司 1223 運分公司 826 關(guān) 950 鹽廠 1086 化冶金廠 198 他 473 計 12388 上表所示，從金川集團股份有限公司二級單位的分布來看，由金川集團有限公司專業(yè)技術(shù)人員根據(jù)二級單位不同的生產(chǎn)工藝流程以及產(chǎn)生的鎳化合物種類以及車間中職工所接觸的鎳化合物濃度，選取人數(shù)所占比例最多的冶煉廠（ 和精煉廠（ 作為候選廠研究對象，由于冶煉廠在接觸暴露的濃度、劑量和人數(shù)比例上占優(yōu) 勢，所以選取冶煉廠作為重點廠區(qū)來進行抽樣研究。 蘭州大學碩士研究生學位論文 鎳冶煉職工氧化損傷修復標志物的作用研究 16 冶煉職工組和 機關(guān)職工 組的抽樣情況 我們依據(jù)不同職業(yè)人群對鎳及其化合物的接觸機會的不同，根據(jù)金川公司的劃定，從體檢人群抽取 280 人。其中 鎳冶煉職工 組為冶煉廠鎳冶煉作業(yè)工人，男性 ,共 140 人 , 20 ， 平均年齡 ( 歲 ； 機關(guān)職工 組為該企業(yè)的機關(guān) 職工 ，男性，共 140 人 , 平均年齡 , 24 。 兩組在性別 、年齡上差異無統(tǒng)計學意義 （ p=。根據(jù)不同職業(yè)將兩組分為干部、 工人、技術(shù)人員和內(nèi)勤服務(wù)人員。 鎳冶煉職工組 將 140 個人按照工齡段分為七組，樣本抽取情況見表 2機關(guān)職工組 依據(jù)與 鎳冶煉職工組 年齡匹配的原則相應分成七組 (對角線每組抽取 20 人 )。 所有調(diào)查對象均身體健康 ,近期未使用任何藥品 。 表 2鎳 冶煉 職工 組 7工齡段抽樣分布 工齡段 年齡段 合計 20- 25- 30- 35- 40- 45- 50- 00 4 12 19 28 22 4 109 5- 0 20 0 21 21 30 9 101 10- 0 1 20 50 17 21 6 115 15- 0 0 5 80 57 42 11 195 20- 0 0 1 36 72 26 4 139 25- 0 0 0 1 50 192 28 271 30- 0 0 0 0 1 17 21 39 合計 20 25 38 207 246 350 83 969 驗材料 要儀器及耗材（見表 2 劑盒 超氧化物歧化酶（ 測定試劑盒， 96T，生產(chǎn)批號： 20120720；丙二醛（ 定試劑盒，生產(chǎn)批號： 20120720；均由南 京建成生物工程研究所生產(chǎn)。 品的制備 采集每個研究對象晨起空腹靜脈血 5輕輕搖勻，置低溫超速離心機，2000r/心 10心半徑 1量移液器吸取上層的血清。取得的樣本放置于 冰箱保存?zhèn)溆谩?蘭州大學碩士研究生學位論文 鎳冶煉職工氧化損傷修復標志物的作用研究 17 表 2實驗所用儀器與耗材 儀器與耗材 制造商 型號 生物安全柜 上海瑞仰凈化裝備有限公司 學顯微鏡 本 冰箱 青島海爾股份有限公司 動酶標分析儀 國 電熱恒溫水浴鍋 北京市長風儀器儀表公司 熱恒溫鼓風干燥箱 海一恒科技有限公司 溫超速離心機 司 (德國） 5415R 漩渦混合器 北京東方生物科學器材公司 式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠 量移液器 上海雷勃分析儀器公司 550l、 20200l、 1 氧化損傷指標的測定 用紫外可見分光光度法測定各指標的 ，單個指標的測定方法為： 定采用 ； 量的測定采用硫代巴比妥酸法。 清中 力的測定原理及公式 （ 1）計算公式：在本反應體系中 制率達 50%時所對應的酶量為一個力單位（ U）。 制率（ %） =(A 對照 照空白 )-(A 測定 定空白 ) (A 對照 照空白 ) 100 血清 U/= 制率 50%反應體系稀釋倍數(shù)樣本測試前稀釋倍數(shù)。 （ 2）簡要步驟：取出 20l 血清樣本，按照樣本與生理鹽水 1:2、 1:4、 1:5和 1:6 進行稀釋，取稀釋后樣本 20l 進行測試。加樣流程見下表。 表 2加入物（ l ） 測定孔 對照孔 對照空白孔 測定空白孔 樣本溶液 20 / / 20 雙蒸水 / 20 20 / 酶工作液 20 20 / / 酶稀釋液 / / 20 20 底物應用液 200 200 200 200 混勻， 37 孵育 20450酶標儀測定，蒸餾水調(diào)零，測定各管 （ 3）原理： 蘭州大學碩士研究生學位論文 鎳冶煉職工氧化損傷修復標志物的作用研究 18 圖 2定 清中 量的測定原理及公式 （ 1） 原理：過氧化脂質(zhì)產(chǎn)物 與硫代巴比妥酸（ 合，形成紅棕色的三甲川，在 532在最大吸收波長。 （ 2）簡要步驟：加樣流程見下表。 表 2比色法測定血清中 試劑（ l ） 標準管 標準空白管 測定管 測定空白管 10準品 25 / / / 無水乙醇 / 25 / / 血清樣本 / / 25 25 試劑一 25 25 25 25 混勻 試劑二 750 750 750 750 試劑三 250 250 250 250 50%冰醋酸 / / / 250 漩渦混勻， 95 水浴 40出流水冷卻，然后 4000r/心 10上清， 5321徑，蒸餾水調(diào)零，比色測定各管 。 （ 3）計算公式：血清 量（ nm/=（測定管 定空白管 （標準管 準空白管 標準品濃度稀釋倍數(shù) O 2+ 州大學碩士研究生學位論文 鎳冶煉職工氧化損傷修復標志物的作用研究 19 據(jù)整理與統(tǒng)計學分析 計量資料用均數(shù)標準差（ x s）表示，采用 行統(tǒng)計分析， 鎳冶煉職工組與機關(guān)職工組 的數(shù)據(jù)比較采用析因（平衡數(shù)據(jù)）設(shè)計的雙因素方差分析，同一組別不同工齡段的數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析進行顯著性檢驗，同時進一步采用 進行兩兩比較，使用 003 及 公軟件制作圖表，以 量。 不同工齡段 *不同接觸組兩個因素間不存在交互作用（ p無統(tǒng)計學意義，而兩個因素對 量改變可能存在獨立的影響。 方（ b= b a*b， 可以認為各處理因素對總變異的和貢獻是因素 a因素 b因素 a*b。 由以上分析可知不同工齡段之間存在統(tǒng)