【畢業(yè)學(xué)位論文】（Word原稿）棉屬8個(gè)基因組物種熒光原位雜交比較及其起源與演化研究作物遺傳育種博士論文

密級(jí)： 論文編號(hào)： 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 學(xué)位論文 棉屬 8 個(gè)基因組 物種 熒光原位雜交比較及其 起源與演化 研究 on on I 摘 要 棉花是我國(guó)乃至世界上最重要的纖維經(jīng)濟(jì)作物 ，闡明棉花的遺傳進(jìn)化和遺傳親緣關(guān)系，對(duì)于棉花遺傳改良具有重要的理論和實(shí)踐意義。 本研究以 16 個(gè)棉種為材料進(jìn)行熒光原位雜交分析 ，以明確 其種間關(guān)系和起源與演化規(guī)律 。主要研究結(jié)果如下 : 1 以 45S 探針，對(duì)二倍體棉種 A、 B、 C、 D、 E、 F、 G 等 7 個(gè)基因組共 9個(gè)棉種 究發(fā)現(xiàn)，除索馬里棉有 4 個(gè) 號(hào)、長(zhǎng)萼棉有 2 個(gè) 號(hào)、比克氏棉有 8個(gè) 余二倍體棉種均有 6個(gè) 顯看到亞洲棉有2 個(gè)強(qiáng)的雜交信號(hào)位于染色體短臂的近端部， 2 個(gè)中等強(qiáng)度的雜交信號(hào)也位于染色體短臂的近端部，另外 2個(gè)弱信號(hào)位于染色體短臂端部，而草棉的 6個(gè)雜交信號(hào)中 4個(gè)為中等強(qiáng)度的信號(hào)， 2個(gè)為弱信號(hào)。三裂棉的 6個(gè) 45S 且全部位于染色體短臂的端部 。值得注意的是在雷蒙德氏棉棉的 6 個(gè)交信號(hào)中，其中 2 個(gè)比較清楚的可以看到大的隨體， 交位點(diǎn)位于次縊痕處。在所有的以 45萼棉和比克氏棉是 2個(gè)特殊的棉種，長(zhǎng)萼棉的 45S 交信號(hào)最少，僅有 2 個(gè)，并且位于著 次縊痕處 ，這一點(diǎn)不同于其他棉種，其他棉種的 45S 交信號(hào)位于染色體的端部或近端部；比克氏棉有8個(gè) 45S 中 2個(gè)強(qiáng)信號(hào)雜交位點(diǎn)位于染色體長(zhǎng)臂的端部，這也是該棉種與其他棉種的不同之處。 2 在以自身基因組 身染色體 非利加棉和雷蒙德氏棉具有不同的結(jié)果。對(duì)于阿非利加棉而言，所有的染色體均有比較強(qiáng)的信號(hào)分布，但是也可以看出，這些信號(hào)主要分布在染色體中部，個(gè)別染色體上雜交信號(hào)僅僅在著絲粒上，而在染色體的端部卻沒有雜交信號(hào)。而對(duì)于雷蒙德氏棉而言，雜交信號(hào)要弱的多。 3 以 1 染色體為靶 亞洲棉石系亞一號(hào)為探針，以雷蒙德氏棉封阻的結(jié)果，可以明顯的看到 26條紅色的 6條藍(lán)色的 觀地證實(shí)了陸地棉是一個(gè)雙二倍體起源的棉種。以 地棉染色體為靶 魚 精 中有 2個(gè)強(qiáng)信號(hào)位于 明陸地棉的供體種是亞洲棉而非草棉。 4 以陸地棉染色體為靶 陸地棉染色體為靶 明陸地棉的 45S 基因組提供。 5 在所有以陸地棉染色體為靶 維遜氏 為探針的雜交信號(hào)最強(qiáng)，說明陸地棉的 6 海島棉具有 6個(gè) 中 2個(gè)在 4個(gè)在 并且海島棉的 亞染色體組。 7 以海島棉染色體為靶 蒙德氏棉為探針的雜交中信號(hào)最強(qiáng)，說明海島棉與雷蒙德氏棉的親緣關(guān)系最近，雷蒙德氏棉為海島棉 8 以阿非利加棉基因組為探針，以黃褐棉基因組為靶 鮭魚精 阻的試驗(yàn)，黃褐棉的 26個(gè) 2個(gè)大的 亞基因組上，但沒有發(fā)現(xiàn)另外 4個(gè) 黃褐棉基因組為靶 阿非利加棉基因組為探針，以戴維遜氏棉封阻時(shí)，也僅能看到 2 個(gè) 雙色熒光原位雜交發(fā)現(xiàn)，黃褐棉的所有 6 個(gè) 位 于 A 基因組上。并且這些所有的 45S 在位點(diǎn)已全部同步進(jìn)化為 9 瑟伯氏棉的基因組與黃褐棉的 斷瑟伯氏棉為黃褐棉 關(guān)鍵詞 ： 棉花 ， 基因組 ， 起源 ， 演化 he is in It is to on in to of as 1. 5S in of in of in of in of It is 5S is in 5s in 45S in of 2. as . as of in in of 3. 6 6 as as as It is a is of . to a D 5. is of . of in of in OR . is of of . 6 as as NA as in is G. as as of in on in of 5S to a A 9. is of ey V 英文縮略表 英文縮寫 英文全稱 中文名稱 細(xì)菌人工染色體 bp 基對(duì) 牛血清白蛋白 cM 摩 綠體 十六烷基三甲基溴化胺 6, 62二乙基二硫代氨基 酸 in 位雜交 乙二胺四乙酸二鈉 in 熒光原位雜交 異硫氰酸熒光素 因組 h 時(shí) 內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū) 因的間隔區(qū) kb 堿基 鐘 核仁組織區(qū) 酸鹽緩沖液 萬分之一 糖體 DS 二烷基磺酸鈉 魚精子 AC 酵母人工染色體 錄 第一章 文獻(xiàn)綜述 . 1 屬的分類研究 . 1 倍體棉種起源與演化的研究 . 4 倍體棉種起源與演化的研究 . 7 屬起源與演化的 究 . 9 術(shù)的發(fā)展 . 9 針的的標(biāo)記及其種類 . 9 術(shù)在棉花起源與演化研究中的應(yīng)用 . 12 復(fù)序列的研究 . 15 復(fù)序列的分類和結(jié)構(gòu) . 15 復(fù)序列的功能 . 15 復(fù)序列的同步進(jìn)化 . 17 復(fù)序列的應(yīng)用 . 19 研究 的目的、意義 . 21 第二章 二倍體棉種熒光原位雜交分析 . 22 驗(yàn)材料 . 24 試材料 . 24 試探針 . 25 要試劑 . 25 驗(yàn)方法 . 25 探針 提取 . 25 色體制片 . 28 針的制備 . 28 性和雜交 . 29 脫和信號(hào)檢測(cè) . 29 光觀察 . 29 據(jù)統(tǒng)計(jì) . 30 果與分析 . 30 倍體棉種的 45S 光原位雜交分析 . 30 倍體棉種的基因組比較熒光原位雜交分析 . 34 論 . 37 于 . 37 關(guān)于長(zhǎng)萼棉的分類地位 . 37 于比克氏棉的分類地位 . 38 第三章 四倍體栽培棉種熒光原位雜交分析 . 39 料與方法 . 40 試材料 . 40 驗(yàn)方法 . 40 果與分析 . 41 地棉基因組的熒光原位雜交分析 . 41 島棉基因組的熒光原位 雜交分析 . 45 論 . 49 倍體棉種 A 亞基因組供體種的問題 . 49 倍體棉種 D 亞基因組供體種的問題 . 50 因組間重復(fù) 列的同源性 . 52 、 D 基因 組與四倍體棉種亞基因組的關(guān)系 . 53 第四章 四倍體野生棉種熒光原位雜交分析 . 55 料與方法 . 55 試材料 . 55 驗(yàn)方法 . 56 果與分析 . 56 論 . 60 褐棉與四倍體栽培種 較 . 60 倍體棉種中的 步進(jìn)化 . 61 于 丟失 . 62 褐棉的供體種 . 63 第五章 全文結(jié)論 . 66 參考文獻(xiàn) . 69 致謝 . 78 作者簡(jiǎn)歷 . 79 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 博 士學(xué)位論文 第一章 文獻(xiàn)綜述 1 第一章 文獻(xiàn)綜述 屬的分類研究 棉屬 (分類上屬于被子植物錦葵目 (錦葵科 (棉族 (棉屬是棉族中第一個(gè)被林奈 (1753)所命名并加以描述的一個(gè)屬 (最初只有 3 個(gè)種 (亞洲棉 (.)、草棉 (.)和海島棉 (.)，后來林奈又增加了 2 個(gè)種：陸地棉 (.)和宗教棉 (.)。十九世紀(jì)中葉，意大利植物學(xué)家 表了有關(guān)棉屬專題論著 (866;877)，對(duì)棉屬分 類首次進(jìn)行了專門的研究。 他的專論中，棉屬被分成 54 個(gè)種。這是一部十分成熟的論著， 979)因而稱其為棉屬分類史上的第一個(gè)里程碑。 1907 年， 界野生棉和栽培棉為棉屬分類樹立了第二個(gè)里程碑。在他的專著中，將棉屬分成 42 個(gè)種和 21 個(gè)變種。 早期的棉屬植物分類研究，基本依據(jù)是棉屬植物的形態(tài)特征和地理分布。由于棉屬植物的世界性分布，其形態(tài)特征和生長(zhǎng)習(xí)性存在著廣泛的變異，不同的分類學(xué)家所偏重的形態(tài)特征不盡相同，因而，早期分類始終未能擺脫混 亂的局面。據(jù) 976)統(tǒng)計(jì)，在棉屬的分類歷史中，棉屬的種名竟達(dá) 675 個(gè)之多。 細(xì)胞學(xué)研究手段得以廣泛應(yīng)用之后，棉屬的分類才有了關(guān)鍵性的突破。 1903 年，先報(bào)道了海島棉和陸地棉棉雜交種染色體數(shù)目 X=28，后來 910)報(bào)道了海島棉品種 染色體數(shù) X=20。盡管他們的結(jié)論顯然都是錯(cuò)誤的，但他們確為棉屬細(xì)胞學(xué)研究的開拓者。二十年后， 1923）提出亞洲棉和草棉的體細(xì)胞染色體數(shù)目 2n 26，陸地棉和海島棉的染色體數(shù)目 2n=52。隨后 924)證實(shí)了 結(jié)論。這些工作為棉屬的染色體組 (分和細(xì)胞學(xué)分類奠定了基礎(chǔ)。 1928 年， 專著棉屬分類的貢獻(xiàn)根據(jù)前人和他本人對(duì)棉花染色體數(shù)目的研究成果，把染色體數(shù)目和倍性作為棉屬分類的主要依據(jù)，并結(jié)合形態(tài)特征和地理分布，把棉花分成兩大類、四個(gè)亞類、 16 個(gè)種，即舊世界的二倍體棉 (2n=2x=26)和新世界的四倍體棉 (2n=2x=52)二個(gè)大類。新世界棉又分成中美洲亞類和南美洲亞類，舊世界棉分成非洲亞類和亞洲亞類。 形態(tài)特征 千差萬別的具有纖維的棉種，以其共同的細(xì)胞學(xué)特征進(jìn)行歸類，每個(gè)亞類又具有完整的地理分布，為棉屬的正確分中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 博 士學(xué)位論文 第一章 文獻(xiàn)綜述 2 類指明了方向。 在棉屬分類學(xué)中作出劃時(shí)代貢獻(xiàn)的當(dāng)推美國(guó)的 940， 1942)。他在總結(jié)前人已積累的棉屬細(xì)胞遺傳學(xué)知識(shí)的基礎(chǔ)上結(jié)合他本人進(jìn)行的大量的種間雜交研究成果，以雜種后代減數(shù)分裂時(shí)染色體的配對(duì)情況為依據(jù)，參照棉種的地理分布，提出了劃分染色體組的細(xì)胞學(xué)分類原則：即凡種間染色體同源性較高的棉種歸為同一染色體組，反之則列為不同的染色體組。據(jù)此將二倍體棉種分為 A、 B、 C、 D 和 E 等 5個(gè)染色 體組，分別代表亞洲棉、非洲棉、澳洲棉、美洲棉和阿拉伯棉種的染色體組。四倍體棉種被認(rèn)為是 A 染色體組和 D 染色體組種間雜交產(chǎn)生的雙二倍體種，因此，將其定為 色體組。至此，現(xiàn)代棉屬的分類框架才最終得以形成。以后的有關(guān)棉屬的分類研究基本上就是在此框架內(nèi)進(jìn)行一些種或亞種（變種）的修訂及新種的發(fā)現(xiàn)、鑒定、定名等工作。 在東非征集到的新種長(zhǎng)萼棉（ 地理分布地歸為E 染色體組， 1961）把它確定為 966)等根據(jù)陸地棉 長(zhǎng)萼棉的雜種 倍體（ 2n=3X）及人工合成的六倍體 (2n=6x)細(xì)胞學(xué)研究，并參考前人關(guān)于陸地棉和海島棉 色體組與 A、 B、 C、 D 和 E 染色體組雜交后產(chǎn)生的倍體和六倍體的染色體配對(duì)資料進(jìn)行了比較分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn) 萼棉與 在減數(shù)分裂時(shí)二價(jià)體和多價(jià)體頻率有顯著的差異， 萼棉的三倍體的單細(xì)胞平均二價(jià)體為 均多價(jià)體為 的二價(jià)體和多價(jià)體分別為 明長(zhǎng)萼棉與 E 染色體組對(duì) 色體組棉種的遺傳親和性有很大的差異。同時(shí)在染色體大小上， E 具 有較長(zhǎng)的染色體，而長(zhǎng)萼棉卻是中等大小的染色體。據(jù)此，966)把長(zhǎng)萼棉定為一個(gè)新的細(xì)胞型從而提出 F 染色體組，把長(zhǎng)萼棉確定為 原產(chǎn)于澳大利亞的比克氏棉（ 曾確定為 據(jù) 1979）的核型分析，它的核型顯著不同于 C 染色體組的模式種斯特提棉(其染色體普遍較小，單細(xì)胞中染色體的總長(zhǎng)度和單個(gè)染色體的平均長(zhǎng)度分別比斯特提棉減少 且比克氏棉無隨體，這是當(dāng)時(shí)棉屬中各棉種 所沒有的現(xiàn)象。據(jù)此， （ 1979）提出將比克氏棉從 C 染色體組分出，另立為 G 染色體組，并確定比克氏棉為 而王坤波等（ 1994）的核型分析提供了清淅可辯的照片，比克氏棉明顯具有兩對(duì)隨體。王坤波等（ 1994）通過比克氏棉與木槿組（ 其它棉種在隨體數(shù)及 m 和 色體數(shù)目比較分析，不支持比克氏棉單獨(dú)另立染色體組，建議與木槿組的其他棉種歸為一個(gè)新的染色體組。最近， （ 1991）研究了比克氏棉、斯特提棉、澳洲棉、和奈爾遜氏棉的葉綠體 核糖體 限制性內(nèi)切酶的內(nèi)切位點(diǎn)。結(jié)果表明，比克氏棉的中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 博 士學(xué)位論文 第一章 文獻(xiàn)綜述 3 葉綠體 斯特提棉的葉綠體 在著很大的同源性；核糖體 與澳洲棉和奈爾遜氏棉的同源性較好。他們認(rèn)為比克氏棉來源于兩個(gè)祖先：類似斯特提棉的祖先種只提供細(xì)胞質(zhì)；類似澳洲棉或奈爾遜氏棉的祖先種提供細(xì)胞核。 (1997)的 析結(jié)果也支持這種看法。由此可以看出比克氏棉染色體組的復(fù)雜性，值得進(jìn)一步深入的探索與研究。 最近 991)等對(duì)在澳大利亞 區(qū)發(fā)現(xiàn)的棉種進(jìn)行研究，考慮到這些 棉種全部起源于 區(qū)，將這些棉種劃歸為 K 染色體組。 在棉屬分類史上， 947)的分類方案上也占有重要的地位。947)繼承了 928)的思路并吸收了 1940,1942)的研究成果，在其棉屬的進(jìn)化專著中將棉屬分為 8 個(gè)組， 20 個(gè)種。 1954 年 947)分類方案相似。 1979 年， 照947 和 954)的分類方案，根據(jù) 1928)的分類傳統(tǒng)，采用940,1942)的染色體組表示方法，進(jìn)行修訂，將棉屬分成 4 個(gè)亞屬 (7 個(gè)組 ( 10 個(gè)亞組 ( 39 個(gè)種，這是一種比較系統(tǒng)、最具權(quán)威并被廣泛接受的棉屬分類方案。近年來，隨著新棉種的不斷發(fā)現(xiàn)、補(bǔ)充和棉屬研究工作的不斷深入， 1992 年 次修訂了其棉屬分類方案，將棉屬分成 4 個(gè)亞屬、 8 個(gè)組、 9 個(gè)亞組 50 個(gè)種，這是目前最新的分類方案（表 1）。 表 . of 名 中 譯 名 染色體組 地理分布 o f sp n 草棉 A 1 中東和非洲 m 亞洲棉 A 2 遠(yuǎn)東和印度 桑納爾棉 B 非洲 異常棉 B 1 非洲 三葉棉 B 2 非洲南部 頂棉 B 3 佛得角群島 m 三叉棉 B 非洲 斯特提棉 C 1 澳洲中部 南岱華棉 C 1 - N 澳洲東南部 魯賓遜氏棉 C 2 澳洲西部 澳洲棉 C 澳洲中北部 納爾遜氏棉 C 澳 洲中部 寧漢氏棉 C 澳洲最北部 瑟伯氏棉 D 1 亞利桑那州 辣根棉 D 2 - 1 墨西哥，加里福尼亞 哈克尼西氏棉 D 2 - 2 墨西哥，加里福尼亞 戴維遜氏棉 D 3 - d 墨西哥，加里福尼亞 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 博 士學(xué)位論文 第一章 文獻(xiàn)綜述 4 續(xù)表 1 . 名 中 譯 名 染色體組 地理分布 o f sp n 克勞茨基棉 D 3 - k 加拉帕戈斯 地棉 D 4 墨科利馬地區(qū) 雷蒙德氏棉 D 5 秘魯 擬似棉 D 6 墨互哈卡州 裂片棉 D 7 墨米卻肯州 三裂棉 D 8 墨西哥西部 散棉 D 9 墨哥雷羅 特納氏棉 D 10 墨索諾拉州 施沃恩蒂曼氏棉 D 11 墨西哥 斯篤克氏棉 E 1 阿拉伯地區(qū) 索馬里棉 E 2 北非 G.a 亞雷西棉 E 3 南也門 白棉 E 4 阿拉伯南部 貝納鈥爾棉 E 北非 布雷切狄氏棉 E 北非 佛倫生棉 E 索馬里 長(zhǎng)萼棉 F 1 非洲東部 比克氏棉 G 1 澳洲中部 孿生葉面棉 K 澳大 利 亞 金 伯 利 地區(qū) m 皺殼棉 K 澳 大 利 亞 金 伯 利 地區(qū) 楊葉棉 K 澳 大 利 亞 金 伯 利 地區(qū) m 小麗棉 K 澳 大 利 亞 金 伯 利 地區(qū) 絨棉 K 澳 大 利 亞 金 伯 利 地區(qū) 地棉 K 澳 大 利 亞 金 伯 利 地區(qū) 小小棉 K 澳 大 利 亞 金 伯 利 地區(qū) 倫敦德里棉 K 澳 大 利 亞 金 伯 利 地區(qū) 馬全特氏棉 K 澳 大 利 亞 金 伯 利 地區(qū) 貴棉 K 澳 大 利 亞 金 伯 利 地區(qū) 園葉棉 K 澳 大 利 亞 金 伯 利 地區(qū) 陸地棉 (1 中美洲，世界廣泛栽培 海島棉 (2 南美，世界廣泛栽培 m 毛棉 (3 夏威夷 黃褐棉 (4 巴西 達(dá)爾文氏棉 (5 加拉帕戈斯群島 可以看出 ,經(jīng)形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)研究形成棉屬的分類框架后，有關(guān)棉屬物種的研究，以分類涵義而言，僅限于少數(shù) 物種的調(diào)整修訂及新種的發(fā)現(xiàn)、定名等工作?？傮w而言，對(duì)棉屬細(xì)胞學(xué)為主的分類系統(tǒng)未作重大改變。也就是說，以鑒