富含花青素植物的篩選及改善動(dòng)脈粥樣硬化的作用機(jī)制之農(nóng)學(xué)研究

1、富含花青素植物的篩選及改善動(dòng)脈粥樣硬化的作用機(jī)制之農(nóng)學(xué)研究本文是一篇農(nóng)學(xué)論文，本課題通過設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)，采用室溫組織破碎提取法同時(shí)結(jié)合超聲提取法優(yōu)化了花青素的最佳提取工藝，采用大孔吸附樹脂柱色譜法優(yōu)化了花青素的富集純化工藝，獲得了制備花青素純化物的最佳工藝。該工藝方法具有提取快速充分、完全，采用室溫提取、低溫快速高效濃縮，最大限度的保留了花青素成分不受破壞，花青素的保留率和轉(zhuǎn)移率高等特點(diǎn)。1 文獻(xiàn)綜述1.1 花青素研究進(jìn)展1.1.1 花青素植物資源研究進(jìn)展花青素廣泛存在于植物的液泡中，使植物呈現(xiàn)紅色、紫色或藍(lán)色。目前在我們吃的食物中越來越常見。最早最豐富的花青素是在 1879 年由意大利人從紅葡

2、萄渣中提取得到4。后來人們發(fā)現(xiàn)野生藍(lán)莓也富含花青素5。Mizgier 等人研究發(fā)現(xiàn)紫胡蘿卜和紫甘藍(lán)中含有花青素，且其中大部分為酰基化花青素6。Antonia 等人發(fā)現(xiàn)黑醋栗中總花青素含量在 205±29 2110±376μgCyG/100 g，并鑒定出矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、芍藥色素-3-O-葡萄糖苷等五種不同的花色苷7。到目前為止，在被子植物中已有 27個(gè)科 73 個(gè)屬被發(fā)現(xiàn)含有花青素。1.1.2 花青素提取與純化技術(shù)研究現(xiàn)狀花青素還是一種天然水溶性色素，美國、日本等發(fā)達(dá)國家很早將花青素作為色素運(yùn)用于食品和飲料中，花青素作為天然色素，易溶于水、無毒、無害

3、、安全性高、而且著色度亮麗3?；ㄇ嗨乜诜笤谖负托∧c中能被快速吸收，但生物利用度僅有0.004%-0.1%8。因此提取純化花青素并對(duì)花青素生物活性研究具有重要意義。提取花青素傳統(tǒng)的提取方法是溶劑萃取法，常用甲醇、乙醇、丙酮、水或混合溶劑等直接浸提一定時(shí)間。后來發(fā)現(xiàn)非?；幕ㄇ嗨卦谔崛∵^程中會(huì)降解，因此在提取溶劑中加入 1%鹽酸或甲酸9。李菊梅等人用鹽酸-乙醇溶液萃取葡萄皮渣中的花青素10。但是這種提取方法耗時(shí)長，溶劑耗費(fèi)多且提取效率低。在縮短提取時(shí)間的基礎(chǔ)上，Arapitsas 等人11利用加壓萃取了紫甘藍(lán)中的花青素，通過增加壓力來提高溶劑的沸點(diǎn)，從而增加花青素在乙醇溶劑中的溶解度，提高了提

4、取效率。Sun 等人12用微波輔助提取紅樹莓中的花青素為 363.9 μg/g FW。顧紅梅13等人將超聲波提取法和溶劑萃取法提取的紫薯花青素進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)超聲法提取提取時(shí)間短，且能避免熱敏性花青素因溫度升高而被破壞， 大大提高了提取效率。近年來，組織破碎提取法被廣泛運(yùn)用于中藥成分的提取，該方法能在數(shù)十秒內(nèi)將植物破碎成微顆粒，使 80%的有效成分快速溶解轉(zhuǎn)移到溶劑中，極度適合熱敏性和易受空氣影響的成分的提取，具有提取時(shí)間短、效率高、適用材料廣、溶劑用量小、操作簡單，節(jié)約能源等優(yōu)勢。鄧引梅14等人利用閃式破碎提取法提取的甘草葉中的總黃酮高達(dá) 2.91%。曹站霞15利用破碎提取法提取了葡萄籽

5、中總多酚成分。金小燕16等人利用閃式破碎提取法提取了甘蔗皮中的原花青素，均取得了好的試驗(yàn)效果。.1.2 黑枸杞花青素研究進(jìn)展黑枸杞(Lycium ruthenicum)，系茄科，枸杞屬植物，又名黑果枸杞。主要分布在我國西北部、中亞、歐洲等地區(qū)，是一種典型的荒漠植物，耐干旱、耐鹽堿、耐貧瘠，具有保持水土流失和土地沙漠化的作用42。據(jù)藏醫(yī)藥典記載，黑枸杞主治心熱病、心臟病和月經(jīng)不調(diào)等43。黑枸杞的果實(shí)成熟后呈現(xiàn)紫黑色，富含花青素、氨基酸、多糖、維生素和微量元素等成分。黑枸杞中天然色素-花青素受到了學(xué)者們的廣泛關(guān)注。目前關(guān)于黑枸杞花青素的研究大部分集中在對(duì)其花青素的提取純化、成分鑒定及含量分析上。劉

6、增根等44人對(duì)我國西北種植黑枸杞的地區(qū)進(jìn)行調(diào)查發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地黑枸杞花青素含量差異較大，同一產(chǎn)地差異不顯著，但青海柴達(dá)木地區(qū)種植的黑枸杞花青素含量最高。有研究報(bào)道，黑枸杞是目前花青素含量最高的食物，被稱為花青素之王;，其花青素含量約為藍(lán)莓的 5-10 倍45。劉振華等46人利用單因素和正交試驗(yàn)考察出最佳提取工藝為用 65%的乙醇溶液，料液比 1:13，在 55浸提 2.5 小時(shí)，提取率最高為0.424%。楊萍等47人用 65%的乙醇溶液采用微波輔助提取黑枸杞花青素，提取率提高到 2.15%，并發(fā)現(xiàn)黑枸杞花青素在 pH3 左右的酸性、低溫、避光、遠(yuǎn)離金屬離子的環(huán)境下穩(wěn)定性最好。Zheng 等48人

7、利用甲醇浸泡提取和 HPLC-DAD 和 HPLC-ESI-MS分析，鑒定出 15 種花青素成分，其中 95%的為矮牽牛素衍生物。關(guān)于黑枸杞花青素的生物活性研究，目前報(bào)道了黑枸杞花青素對(duì) DPPH、O2-和OH 自由基都具有極強(qiáng)的清除能力，且抗氧化性要顯著強(qiáng)于單寧酸，其抗氧化能力與濃度成正相關(guān)性49-51。Yin 等52人發(fā)現(xiàn)黑枸杞花青素能明顯抑制炎癥和增加脂肪酸代謝以改善肥胖癥。Tang 等53人發(fā)現(xiàn)黑枸杞花青素中一種矮牽牛素衍生物可以促進(jìn)抗氧化酶活性和細(xì)胞增殖抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，從而保護(hù)了 PC12 細(xì)胞免受過氧化氫的損害。.2 花青素提取與純化工藝優(yōu)化2.1 試驗(yàn)材料本章以顏色較深，且含

8、水量適中，資源廣泛、價(jià)格便宜的紫胡蘿卜為代表考察了花青素的提取純化工藝。紫胡蘿卜于 2017 年 5 月采摘于山東聊城的立源美農(nóng)特色農(nóng)產(chǎn)品基地。隨著花青素的營養(yǎng)價(jià)值及功效被人們廣泛熟知，出現(xiàn)了越來越多的富含花青素的植物，包括藍(lán)靛果、桑葚、紫甘藍(lán)、紫花菜等等。這些植物不僅含有鮮艷的色彩，增加了植物的觀賞價(jià)值，而且還是天然色素的良好來源，具有無毒、強(qiáng)抗氧化性的特性88。為了提高花青素的利用，常常需要對(duì)植物中花青素成分進(jìn)行提取純化，但花青素穩(wěn)定性差，容易受 pH、溫度和氧氣的影響89，因此選擇恰當(dāng)?shù)姆椒ㄌ崛〖兓ㄇ嗨?，?duì)確保功效成分的存留和活性至關(guān)重要。組織破碎提取法將粉碎和提取過程合二為一同時(shí)完成

9、，具有提取速度極快、效率高、室溫提取，能最大限度的保留熱敏性成分不受破壞等特點(diǎn)。根據(jù)花青素結(jié)構(gòu)的敏感特性，本研究選擇將組織破碎提取法和超聲提取法結(jié)合并用，對(duì) 15 種富含花青素植物采用優(yōu)化的工藝進(jìn)行高效快速提取，并利用大孔樹脂柱色譜法對(duì)花青素提取物進(jìn)行富集純化，采用低溫閃蒸濃縮結(jié)合旋蒸濃縮，得到了花青素純化物。.2.2 實(shí)驗(yàn)方法2.2.1花青素破碎提取工藝考察以紫胡蘿卜為代表考察花青素的最佳提取工藝。按照表 2.1 的 L934正交試驗(yàn)表，采用四因素三水平進(jìn)行設(shè)計(jì)，每一次正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果用紫外分光光度計(jì)測定在 510nm處的吸光值表示，根據(jù)吸光值大小考察和篩選組織破碎提取法的最佳工藝。每一組實(shí)驗(yàn)

10、平行操作 3 次，取平均值。2.2.2花青素超聲提取工藝考察通過破碎提取已將植物打碎成勻漿狀，并將植物細(xì)胞中的大部分花青素成分快速轉(zhuǎn)溶于溶劑中，通過過濾得到提取液。但由于提取時(shí)間短，濾渣中仍殘存部分花青素成分。為了增加提取率和便于過濾，不宜繼續(xù)用破碎提取法提取，而是結(jié)合超聲提取法將濾渣在室溫下再次提取。超聲提取工藝優(yōu)化采用表 2.2 的 L933正交試驗(yàn)法，采用三因素三水平進(jìn)行設(shè)計(jì)。每一次正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果通過測定在 510nm 處的吸光值表示，根據(jù)吸光值大小考察和篩選超聲提取法的最佳工藝。每一組實(shí)驗(yàn)平行操作 3 次，取平均值。 / .3 15 種植物花青素純化物的性能評(píng)價(jià) . 143.1 試驗(yàn)材

11、料 . 143.2 儀器與試劑 . 144 黑枸杞花青素純化物改善動(dòng)脈粥樣硬化實(shí)驗(yàn)研究 . 374.1 材料與試劑 . 374.2 儀器與設(shè)備 . 375 黑枸杞花青素純化物改善動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制研究 . 485.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器 . 485.2 主要儀器 . 485.3 實(shí)驗(yàn)方法 . 495 黑枸杞花青素純化物改善動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制研究5.1實(shí)驗(yàn)方法5.1.1小腸組織病理學(xué)檢測取新鮮小腸組織進(jìn)行 H&E 染色，方法同 4.4.7。5.1.2組織蛋白的提取與濃度測定（1）稱取 0.2 克動(dòng)脈和 0.1 克肝臟組織塊用冷 PBS 洗滌 2-3 次，去除血污，剪成小塊放入勻漿器中，并加入

12、 1mL 的蛋白酶抑制劑，磁珠震蕩 30 秒。然后將裝有勻漿液的離心管，振蕩，冰浴 30 分鐘，期間用移液器反復(fù)吹打，確保組織細(xì)胞完全裂解。最后在 4，12000 轉(zhuǎn)條件下離心 10min，收集上清液，即為總蛋白溶液。（2）根據(jù) BCA 試劑盒說明測定提取的總蛋白濃度，制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖 5.1 所示，在 562nm 波長處檢測吸光值，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線定量各組織樣本的蛋白濃度。 /.6 結(jié)論目前有效緩解和治療動(dòng)脈粥樣硬化的藥物主要為一些他汀類藥物，這些藥物又會(huì)引起便秘、肝損傷等副作用，因此尋找天然產(chǎn)物有效緩解動(dòng)脈粥樣硬化并分析其作用機(jī)制是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。花青素具有極強(qiáng)的抗氧化活性和預(yù)防心腦血管疾

13、病的作用，并且市面上出現(xiàn)了越來越多富含花青素的植物。本文在充分查閱大量文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，選擇了 15 種富含花青素的植物為研究對(duì)象，將破碎提取法和超聲提取法結(jié)合使用，以紫胡蘿卜為代表利用正交試驗(yàn)優(yōu)選出了最佳提取工藝為：以 pH 為 2 的 50%乙醇溶液，按料液比為 1:4 組織破碎提取 1.5min，抽濾，將濾渣再用 pH 為 2 的 50%乙醇溶液按料液比 1:2 在室溫超聲提取 40min，提取1 次。抽濾，合并濾液在 40下采用真空薄膜濃縮裝置進(jìn)行閃蒸濃縮至原體積的 1/5，得濃縮液。再通過 Diaion HP 2 MGL 大孔樹脂進(jìn)行富集純化。濃縮液上樣后先用去離子水洗脫，除去水溶性雜質(zhì)，再用 pH 為 3 的 60%的乙醇溶液洗脫，收集花青素色帶洗脫液，40下閃蒸濃縮結(jié)合旋蒸濃縮至干粉，得到花青素純化物。采用 pH 示差法和 HPLC 法對(duì) 15 種植物花青素純化物中花青素的含量進(jìn)行測定并評(píng)價(jià)了其 DPPH、FRAP、TRP 的抗氧化活性和在不同 pH、光照、溫度條件下的穩(wěn)定性。結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)：漿果類植物的花青素純化物中總花青素含量和抗氧化活性