納米材料與細(xì)胞作用的綜述

1、 畢 業(yè) 設(shè) 計(jì)（綜 述） the review of the interaction of nano materials and cells納米材料與細(xì)胞作用的研究綜述 申請(qǐng)學(xué)位： 學(xué)士學(xué)位 院 系： 藥學(xué)院 姓 名： 孟凡飛 學(xué) 號(hào)： 122120209 指導(dǎo)老師： 張懷斌（講師） 二0一四年六月十二日 目錄摘要.1abstract.2 引言.31納米zno的制備及性質(zhì).31.1 納米zno的制備.31.1.1 制備方法的概述.31.1.2 醋酸鋅法制備納米zno.3 1.2 納米zno的性質(zhì).52納米zno與不同細(xì)胞的相互作用.52.1 納米zno與人支氣管上皮細(xì)胞(beas-2b).5

2、2.2 納米zno黃曲霉細(xì)胞的相互作用.62.3 對(duì)白色念珠菌的生物毒性.62.4 納米zno對(duì)人胚肺成纖維細(xì)胞（helf）的生物毒性的劑量效應(yīng).72.5 尺寸效應(yīng)對(duì)zno納米粒子對(duì)洋蔥表皮細(xì)胞作用的影響.83展 望.93.1 發(fā)展與應(yīng)用.93.2 缺點(diǎn)與改進(jìn).10參考文獻(xiàn).11致謝.13 納米材料與細(xì)胞作用的研究綜述孟凡飛摘要: 從近年來對(duì)于納米材料的安全性評(píng)價(jià)的工作進(jìn)展看，人們對(duì)于現(xiàn)今應(yīng)用較廣的zno納米材料的生物安全性研究較少。本文將著重闡述zno納米材料在機(jī)理、劑量、尺寸方面對(duì)不同生物細(xì)胞的相互作用，為做好納米材料使用的安全防護(hù)工作、研究納米材料在生物安全性方面的影響、建立一套研究納米

3、材料安全性評(píng)價(jià)的方法提供必要依據(jù)。關(guān)鍵詞: zno納米材料；機(jī)理；劑量；尺寸；生物細(xì)胞；相互作用 the review of the interaction of nano materials and cellsmeng fan-feiabstract：from the recent progress about the safety evaluation of nano materials,the research on biological safety of zno nano materials that are widely used today is very less. this

4、paper will focuse on the interaction of different biological cells and zno nano particles in mechanism, dose and size,to do a good job about security protection of nano materials used, research the effects of nano materials in the biological safety, provide the necessary basis for the establishment

5、of a set of research method on safety evaluation of nano materials.keywords：zno nano materials；mechanism；dose；size；biological cells；interaction 引言 納米材料是指至少在一維空間上粒徑不大于100nm的材料，主要有四大類：納米粉末，如納米zno粉末；納米纖維，如碳納米管；納米膜，如納慮膜；納米塊如zro2和tio2納米塊體。由于其尺寸很小，結(jié)構(gòu)特殊，因此具有許多新的物理化學(xué)特性，如尺寸效應(yīng)、大的比表面、極高的反應(yīng)活性、量子效應(yīng)等1。隨著納米技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化，

6、各種納米材料因其優(yōu)良特性及新奇功能而具有廣泛的應(yīng)用前景，遍及工業(yè)、農(nóng)業(yè)、制造業(yè)、軍事、醫(yī)療等諸多領(lǐng)域2。而日常的生活用品中，如化妝品、食品、織物、涂料、抗菌材料等，也含有納米材料，人們接觸納米材料的機(jī)會(huì)同益增多3。由此，納米材料的生物效應(yīng)和安全性問題也凸顯出來，尤其是納米顆粒對(duì)人體健康、生存環(huán)境和社會(huì)安全等方面是否存在潛在的負(fù)面影響。毒理學(xué)研究結(jié)果表明納米顆?？梢砸愿鞣N途徑進(jìn)入人體或生物體，包括吸入、攝食吸收、皮膚滲透等，隨后在生物體內(nèi)產(chǎn)生不同水平的毒理學(xué)效應(yīng)4。 目前體內(nèi)外的實(shí)驗(yàn)證實(shí)納米zno可在不同程度上對(duì)細(xì)菌、水生生態(tài)動(dòng)物、哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，對(duì)多種正?；虿徽＜?xì)胞產(chǎn)生相互作用5。

7、1 納米zno的制備及性質(zhì)1.1 納米zno的制備1.1.1 制備方法的概述 目前實(shí)驗(yàn)室制備的方法主要有以下幾種：（1） 醋酸鋅法 以znac22h2o為原料，經(jīng)溶解，加熱回流，沉淀，洗滌，離心，干燥得本品。然后表征，經(jīng)sem(掃描電子顯微鏡)測(cè)試，x射線衍射，hrtem(高分辨率的透射電鏡)測(cè)試得本品。這也是主要的制備方法。（2）氫氧化鋅法 利用硝酸鋅制得前驅(qū)氫氧化鋅，在600保持2h，高溫?zé)岱纸獾眉{米氧化鋅。 （3）直接沉淀法 在可溶性鋅鹽中加入沉淀劑后，當(dāng)溶液離子的溶度積超過沉淀化合物的溶度積時(shí)，即有沉淀從溶液中析出。沉淀經(jīng)熱解得納米氧化鋅。常見的沉淀劑為氨水、碳酸銨、和草酸銨。此法操作

8、簡(jiǎn)單易行，對(duì)設(shè)備要求不高，成本較低，但粒度分布較寬，分散性差，洗滌原溶液中陰離子較困難。1.1.2醋酸鋅法制備納米zno 將適量znac22h2o稱量后加入到三口燒瓶中，用量筒量取一定體積的xylene溶劑，加入三口燒瓶，攪拌溶解。隨后稱取dbs加入到上述的體系并加入一定的量50n2h4h2o的乙醇溶液。反應(yīng)在室溫條件下進(jìn)行。在滴加的初期，微混的微乳液會(huì)逐漸澄清，但是隨著滴加過程的進(jìn)行，開始出現(xiàn)白色沉淀，直到反應(yīng)結(jié)束，沉淀始終存在。在滴加完畢后，繼續(xù)攪伴14小時(shí)以上，然后加熱回流。回流完畢后，在離心作用下將固體沉淀從溶液中分離出來。將沉淀用特定的溶劑洗滌，以除去多余的雜質(zhì)，經(jīng)過多次的洗滌、離心

9、后，將沉淀在低溫的真空條件下進(jìn)行干燥或者自然干燥，得到干爽的粉末，粉末可以用來測(cè)試結(jié)構(gòu)和性能。更換溶劑和表面活性劑得到其他形貌的產(chǎn)物。在實(shí)驗(yàn)中，對(duì)樣品進(jìn)行了表征，方法如下所示：(1)sem測(cè)試所用的儀器型號(hào)是jeol s4800，加速電壓5kv。樣品 制備：將一小片5wanx5minx2mm的玻璃片在醇中超聲清洗并干燥后，將待粉測(cè)末樣品在乙醇中超聲分散后，滴在干凈的玻璃片上，在室溫下晾干后進(jìn)行噴金處理，處理完畢后可以進(jìn)行測(cè)試。(2)x射線射實(shí)驗(yàn)所用的儀器是日本生產(chǎn)的衍射儀(rigaku，dmax2cu-ka)，所用波長(zhǎng)為1.5406，工作電壓為40kv，電流為30ma，掃描速度為00100/s

10、。樣品是粉末態(tài)，裝在一個(gè)有凹糟的平面玻璃板上，壓平后進(jìn)行測(cè)試。(3)hrtem測(cè)試在jem2100f型高分辨透射電鏡上進(jìn)行。jem高分辨透射電鏡的相關(guān)參數(shù)為：加速電壓，200kv；晶格分辨率，0.14nm；分辨0.23nm；放大倍數(shù)2000-1500000。配有x射線能譜儀和多掃描ccd相機(jī)6。掃描圖像如下圖1. 圖1. 納米zno的形貌，a and b sem，c和d為b中納米棒hrtem圖像1.2納米zno的性質(zhì) 與常規(guī)氧化鋅相比，納米氧化鋅對(duì)生物細(xì)胞具有較強(qiáng)的氧化性、光催化氧化性，與大分子共價(jià)結(jié)合效應(yīng)，尺寸效應(yīng)7，濃度效應(yīng)等，性質(zhì)的不同，直接導(dǎo)致其對(duì)生物細(xì)胞有著不同的影響作用。對(duì)其上述性

11、質(zhì)的研究，安全使用，仍是當(dāng)今納米技術(shù)研究的重要課題。 此外，納米級(jí)氧化鋅還是一種新型鋅源8，具有較高的生物活性、免疫調(diào)節(jié)能力和吸收率，較少的納米氧化鋅即可達(dá)到促進(jìn)生物體生長(zhǎng)的功效9。2 納米zno與不同細(xì)胞的相互作用2.1納米zno與人支氣管上皮細(xì)胞(beas-2b)之間的相互作用 huang10等對(duì)人支氣管上皮細(xì)胞(beas-2b)細(xì)胞進(jìn)行zno納米粒子(20nm)懸液染毒。研究表明，納米氧化鋅對(duì) beas-2b 的毒性，是通過乳酸脫氫酶(ldh)、活性氧(ro)測(cè)定結(jié)果推測(cè)氧化應(yīng)激可能是納米粒子產(chǎn)生細(xì)胞毒性的機(jī)制之一，對(duì)相關(guān)基因進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn) bnip，prdx3，prnp 和 txrnd

12、1 基因表達(dá)異常，說明納米氧化鋅改變了beas-2b 細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控，dna合成受損，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。這與 heng11的研究結(jié)果不謀而合。機(jī)理如下圖2. 圖2. 納米zno顆粒引起氧化損傷并導(dǎo)致dna損傷的毒性機(jī)理示意圖2.2納米zno黃曲霉細(xì)胞的相互作用 納米zno緩釋出的zn+接觸微生物，因細(xì)胞膜帶負(fù)電荷而與zn+發(fā)生庫倫吸引而相互接觸，即所謂的微動(dòng)力效應(yīng)，導(dǎo)致zn+穿透細(xì)胞膜進(jìn)入微生物體內(nèi)，與微生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)上的硫基發(fā)生反應(yīng)使微生物蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)破壞，造成微生物死亡或者產(chǎn)生功能障礙。從而將黃曲霉細(xì)胞殺死12。機(jī)理如下圖3. (蛋白質(zhì))-sh+zn+ (蛋白質(zhì)) szn+h+ (蛋白質(zhì)、核酸)

13、-h+zn+ (蛋白質(zhì)、核酸)-zn+h+圖3. 納米zno殺滅黃曲霉細(xì)胞的作用機(jī)理2.3對(duì)白色念珠菌的生物毒性 到目前為止，由于納米zno的抗菌性能以及它作為一些傳染病的抗菌藥，存在潛在的藥用價(jià)值，許多已經(jīng)發(fā)表的論文中研究了納米粒子對(duì)于微生物的影響。例如，adams等13，brayner等14，以及zhang l15等人的研究都表明納米zno粒子對(duì)于e. col菌的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用。roselli等人的研究也表明，zno可以通過抑制損傷腸細(xì)胞的e.coli菌而保護(hù)腸細(xì)胞16，huang z等人的研究中發(fā)現(xiàn)zno對(duì)于可以導(dǎo)致人類傳染疾病的鏈球菌和葡萄狀球菌有很好的抑制作用17。特別是在光催

14、化對(duì)白色念珠菌等細(xì)菌的殺滅抑制作用18。 納米氧化鋅光催化殺菌劑，通常表現(xiàn)出超過傳統(tǒng)抗菌劑(即僅能殺滅細(xì)菌本身)的性能。對(duì)于納米半導(dǎo)體，當(dāng)粒子細(xì)化到納米尺度時(shí)，產(chǎn)生電子和空穴的氧化還原能力增強(qiáng)19。受陽光和紫外線的照射時(shí)，納米氧化鋅抗菌劑在有水分和空氣存在的體系中能自行分解并釋放出自由電子(e.)，同時(shí)留下帶正電的空穴(h+)，生成的帶羥基的自由基oh和超氧化物陰離子自由基o2都非常活潑，化學(xué)活潑性很強(qiáng)，能與多種有機(jī)物發(fā)生反應(yīng)(包括細(xì)菌內(nèi)的有機(jī)物及其分泌的毒素)從而將微生物殺滅20。納米氧化鋅在陽光尤其是紫外線照射下，具有極強(qiáng)的化學(xué)活性，能與大多數(shù)有機(jī)物(包括細(xì)菌) 發(fā)生氧化反應(yīng)，從而殺死大多

15、數(shù)病菌和病毒21。據(jù)此，可以對(duì)某些癌細(xì)胞進(jìn)行光動(dòng)力殺滅，傳統(tǒng)的光敏分子治療方法相比，避免了光敏分子容易發(fā)生脫落現(xiàn)象，相關(guān)工作還在進(jìn)一步研究當(dāng)中22。作用機(jī)理如下圖4. 圖4. 光激發(fā)zno殺菌機(jī)理 2.4 納米zno對(duì)人胚肺成纖維細(xì)胞（helf）的生物毒性的劑量效應(yīng) 以細(xì)胞生存率為縱坐標(biāo)，對(duì)zno 納米粒子濃度(橫坐標(biāo))作圖，結(jié)果如圖5.所示 圖中可見，helf細(xì)胞與不同濃度的40nm 氧化鋅納米粒子相互作用72小時(shí)后細(xì)胞生存率與納米氧化鋅濃度的增大而急劇減小23。當(dāng)zno 納米粒子濃度低于2.45mg/l時(shí)，細(xì)胞幾乎沒有明顯變化，而當(dāng)濃度達(dá)到約20mg/l時(shí)，細(xì)胞存活率已低于10.這表明細(xì)胞

16、的生存率受納米氧化鋅濃度影響非常明顯。實(shí)驗(yàn)過程發(fā)現(xiàn)， 納米氧化鋅濃度超過40mg/l后，溶液已出現(xiàn)明顯渾濁，影響了光線透光率，導(dǎo)致吸光度失真增大。所以，圖中顯示細(xì)胞生存率下降趨勢(shì)平緩.正如文獻(xiàn)報(bào)道24，在較低濃度時(shí)，氧化鋅納米粒子的生物安全性是也可靠的.本實(shí)驗(yàn)中濃高于20mg/l 時(shí)，人胚肺成纖維細(xì)胞死亡率顯著增加25。 圖5. helf細(xì)胞與不同濃度40nm氧化鋅納米粒子作用后的存活率2.5 zno納米粒子的尺寸效應(yīng)對(duì)洋蔥表皮細(xì)胞作用的影響 寧月輝研究了zno納米粒子和zno納米棒對(duì)洋蔥表皮細(xì)胞的影響。結(jié)果表明：粒徑較小(5 nm)的zno納米粒子能夠透過細(xì)胞壁而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，并且富集在細(xì)胞

17、核上。尺寸較大的zno納米棒則無法穿越細(xì)胞壁。由此可知納米材料的尺寸和形貌是影響其生物效應(yīng)的重要因素26。 通過熒光顯微技術(shù)證實(shí)了直徑5 nm左右的納米氧化鋅粒子能夠穿透洋蔥表皮的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，并富集在細(xì)胞核上，引起細(xì)胞紫外區(qū)發(fā)光特性的改變。納米材料在生物體內(nèi)可以穿過其他材料難以穿越的部位，因此納米材料在生物體內(nèi)可能會(huì)出現(xiàn)特殊的代謝情況，并且可能會(huì)與某些特定部位的器官或者組織細(xì)胞作用進(jìn)而帶來某些特殊毒性，所以富集在細(xì)胞核上的氧化鋅納米粒子對(duì)生物的生長(zhǎng)與發(fā)育可能存在不利影響。直徑約為200 nm的氧化鋅納米棒由于其尺寸較大，難以穿過洋蔥表皮細(xì)胞的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，在細(xì)胞

18、的熒光顯微照片上，沒有觀察到來自細(xì)胞核周圍的綠色熒光。這說明氧化鋅納米材料對(duì)細(xì)胞壁的穿透能力與其形貌和尺寸有密切關(guān)系。當(dāng)我們討論納米物質(zhì)的生物效應(yīng)或毒性這個(gè)問題時(shí)，不能泛泛而言，必須明確材料的種類、形態(tài)、尺寸（粒徑）大小、以及劑量的多少等參數(shù)，即使同一種類的納米材料，當(dāng)其尺寸（粒徑）大小不同，其生物效應(yīng)可能相差很大27。如下圖6. 圖6. zno納米粒子（a）和zno納米棒（b）處理的洋蔥表皮細(xì)胞3 展 望3.1 發(fā)展與應(yīng)用 納米技術(shù)自20世紀(jì)問世以來，納米材料在全世界大量涌現(xiàn)28，越來越多的納米材料應(yīng)用于人們的日常生活，其中，納米zno以其獨(dú)特的性質(zhì)成為近年納米復(fù)合材料的研究熱點(diǎn)，在人類社會(huì)

19、中被廣泛應(yīng)用，包括防曬劑，食品添加劑，傳感器，電子材料等等。近年國(guó)內(nèi)功能型納米復(fù)合材料的應(yīng)用研究十分活躍，已有商品化產(chǎn)品問世，且已有較多的納米粉體生產(chǎn)企業(yè)，可生產(chǎn)各種各樣的用于制備納米復(fù)合材料的粉體材料29。納米zno在生物醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用如：癌癥的治療、細(xì)胞內(nèi)部染色、納米藥物控釋材料、納米抗菌材料、創(chuàng)傷敷料、生物活性材料等，也將會(huì)有更大的發(fā)展利用空間。3.2 缺點(diǎn)與改進(jìn) 其所引起的安全性問題也必須給予足夠的重視?；钚匝醯漠a(chǎn)生和納米粒子的細(xì)胞內(nèi)化是納米粒子與細(xì)胞相互作用過程中的兩個(gè)普遍現(xiàn)象。納米粒子的生物毒性主要是由其內(nèi)核的結(jié)構(gòu)所決定，表面修飾對(duì)納米材料的毒性也起到相當(dāng)重要的作用。對(duì)那些在生物應(yīng)

20、用研究中有重要應(yīng)用的納米粒子，表面修飾的類型是必須考慮的因素。對(duì)毒性有影響的因素還有表面電荷，陽離子毒性比陰離子毒性更強(qiáng)一些，中性表面納米粒子具有最強(qiáng)的生物相容性。究其原因可能是陽性粒子比較容易接近帶負(fù)電的細(xì)胞膜30。2003年的美國(guó)化學(xué)會(huì)年會(huì)上報(bào)告了納米顆粒對(duì)生物可能的危害。2003年4月science31、2003年7月nature32相繼發(fā)表編者文章，開始討論納米尺度物質(zhì)的以及對(duì)環(huán)境和健康的影響問題。2004年1月美國(guó)化學(xué)會(huì)的enviromental science & technologies33雜志、2004年6月science34再次載文強(qiáng)調(diào)，必須對(duì)納米技術(shù)的安全性問題進(jìn)行研究。英

21、國(guó)皇家學(xué)會(huì)和皇家工程院于2004年7月29日發(fā)布長(zhǎng)達(dá)95頁的報(bào)告，建議英國(guó)政府成立“納米物質(zhì)生物環(huán)境效應(yīng)”研究中心，以期對(duì)納米材料的安全使用，提供更多的依據(jù)，造福人類。參考文獻(xiàn)1 roc mc. nanotechnology: convergenc with moden biology and medicinej. curr opin biotechnol, 2003, 14(6): 337-346.2 freitas ra. what is nanomedicine? j. nanomedicine. 2005.1: 2-9.3 aitken rj, chaudhry mq, boxall

22、aba.manufacture and use ofnanomaterials: current status in the uk and global trends j. occup med. 2006. 56(5): 300-306.4 brody al. nano and food packaging technologies convergej. food technol, 2006. 60: 92-94.5 趙景霞. 納米氧化鋅對(duì)海馬神經(jīng)元電生理特性的影響及對(duì)pci2細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)的機(jī)制研究d. 天津: 南開大學(xué)研究生院, 2010: 4-6.6 王龍. 幾種納米材料的制備及其安全性

23、評(píng)價(jià)d. 四川: 四川大學(xué)研究生院, 2007: 28-30.7 hoet hm, irene bh, oleg vs.nanoparticles-know and unknow herlth riskj. nanobiotechnology, 2004, 2(12): 1-15.8 高戰(zhàn)軍，顧有松，張躍. 高壓下zno納米線的結(jié)構(gòu)相變和能帶的尺寸效應(yīng)d. 北京: 北京科技大學(xué), 2008: 224-226.9 huang cc, aronstam rs, chen dr, etal. oxidative stress, calcium homeostasis,and altered gene

24、 expression in human lung epithelial cells exposed to znonanoparticles j. toxicology in vitro, 2010, 24(1): 44-45.10 heng bc, zhao xx, xiong sj, etal. toxicity of zinc oxide (zno) nanoparticleson human bronchial epithelial cells (beas-2b) is accentuated by oxidative stressj. food and chemical toxico

25、logy, 2010, 48(6): 1762-1766.11 陳瀟婷. 納米氧化鋅對(duì)人肝腎細(xì)胞的毒性作用研究d. 浙江: 中國(guó)計(jì)量學(xué)院研究院, 2012: 3-6.12 林璋. 納米氧化鋅及其復(fù)合體的防霉和霉菌毒素吸收研究d. 福建: 廈門大學(xué), 2009：42-43.13 campbella, oidham m, becaira a , eta1particulate matter in polluted air may increase biomarkcrs of inflammation in mouse brainj. neurotoxicolog, 2005, 26: 133-14

26、0.14 adams lk , lyon d yand alvarez p j jcomparative cootoxicity of nanoscale ti02, si02, and zno water suspensionsj. water res, 2006, 40(9): 35-45.15 braynerr, ferrari-iliou r, brivois n,djediat s, benedetti m fand fievet f. toxicologicalimpact studies based on escherichia coli bacteria in ultrafin

27、e zno nanoparticles colloidal mediumj. nano lett. 2006, 6(6): 866-870.16 zhang l, jiang y, ding y. investigation into the antibacterial bchaviour of suspensions of zno nanoparticles (zno nanofluids)j. nanopartres2007, 9, 479-48917 roselli m, finamorea.garaguso, i.britti m sand mengheri e.zinc oxide

28、protects cultured enterocytes from the damage induced by escherichia colij. jnutr, 2003, 133: 4077-4082.18 huang z, zheng x, yan d. yin g.liao x, kang y,yao y.huang d and haobj. langmuir. 2008, 24: 4140-4165.19 欒啟夏. 納米氧化鋅對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的作用機(jī)制研究d. 上海: 上海大學(xué), 2009: 6-9.20 何臨海, 孟松, 柳苗苗等. 納米氧化鋅對(duì)白色念珠菌的抗菌作用j. 中國(guó)組織工程研究, 2012, 16(25): 4599-4566.21 li yf, li m. juhewu yu zhuji j. 2008. 13(5): 1-5. 22 李玉芳, 李明. .新型抗菌劑-納米氧化鋅的生產(chǎn)和應(yīng)用進(jìn)展j. 聚合物與助劑, 2008, 13(5): 1-5. 23 yang fx, liu ql. anhui huagongj. 2006; 32(1): 11-1