關于芪丹通脈片聯(lián)合骨髓間充質干細胞移植對急性心肌缺血大鼠心肌細胞凋亡及心功能的影響

1、關于芪丹通脈片聯(lián)合骨髓間充質干細胞移植對急性心肌缺血大鼠心肌細胞凋亡及心功能的影響作者：王文,王宗仁,張金洲,李軍昌,蘇海礫,王文勇,馬福成,李靜 【摘要】目的觀察芪丹通脈片聯(lián)合骨髓間充質干細胞(MSCs)移植對急性心肌缺血大鼠心肌細胞凋亡、心功能的影響。方法采用密度梯度離心法體外分離培養(yǎng)大鼠MSCs,擴增至第3代后,應用溴脫氧尿嘧啶(BrdU)標記細胞。16只健康SD大鼠隨機分為芪丹通脈片聯(lián)合移植組與單純移植組,分別灌服芪丹通脈片浸膏干粉溶液(2g/kg)和等體積生理鹽水,每日1次,連續(xù)14d。結扎大鼠冠狀動脈左前降支,制備急性心肌梗死模型,將BrdU標記的異體MSCs以微量注射的方法移植入

2、缺血心肌內。移植后3h應用HP5500超聲診斷儀,探頭頻率12MHz,檢測大鼠心功能,4周后復查,并用免疫熒光法檢測缺血區(qū)的微血管密度(MVD),用脫氧核苷酸轉移酶(TdT酶)介導的dUTP缺口末端標記法(TUNNEL)檢測心肌細胞凋亡指數(shù)(AI)。結果芪丹通脈片聯(lián)合移植組與單純移植組大鼠心功能均有所改善,而芪丹通脈片聯(lián)合移植組改善更明顯(芪丹通脈片聯(lián)合MSCs移植能改善急性心肌缺血大鼠的心功能,減少心肌細胞凋亡,增加缺血區(qū)MVD,與MSCs單純移植組比較療效更顯著。 【關鍵詞】芪丹通脈片；骨髓間充質干細胞；心功能；心肌細胞凋亡；大鼠 Abstract：ObjectiveToobserveth

3、eeffectofmarrowmesenchymalstemcells(MSCs)transplantationcombinedwithQidantongmaitabletandsimpleMSCstransplantationonmyocardialcellsapoptosisandheartfunctioninacutemyocardialischemiarats.MethodRatMSCswereisolatedbydensitygradientmethod,andthenculturedandamplifiedtothethirdpassagelabeledwithBrdU.16SDr

4、atsweredividedintotwogroupsrandomly,transplantationcombinedwithQidantongmaitabletgroupandsimpletransplantationgroup.TheisochoricofsuspensionofQidantongmaitablet(2g/kg)andNSwereadministeredtoSDratsbygastrogavagerespectivelyfor14days.Theleftanteriordescendingcoronaryarteryofratwasligatedtoestablishani

5、malmodelsofacutemyocardialinfarction.TheMSCslabeledwithBrdUwereimplantedintramyocardiallyintotheinfarctarea.After3hours,theheartfunctionweredetectedbyanechocardiographicsystem(HP5500system),equippedwitha12MHzprobe.After4weeks,theheartfunctionwererecheckedandMVDweredetectedbyimmunofluorescence,myocar

6、dialcellsapoptosisweredetectedbyTUNNEL.ResultsHeartfunctionwereimprovedinbothgroups,andwasmoresignificantinMSCstransplantationcombinedwithQidantongmaitabletgroup.ApoptoticindexweredecreasedandtheMVDofischemiczonewereincreasedintransplantationcombinedwithQidantongmaitabletgroupthansimpletransplantati

7、ongroup.ConclusionMSCstransplantationcombinedwithQidantongmaitabletcouldimproveheartfunctionofacutemyocardialischemiarats,decreaseapoptosisofmyocardialcells,increasetheMVDofischemiczone,thetherapeuticeffectweremoresignificantthansimpleMSCstransplantation. Keywords：Qidantongmaitablet；marrowmesenchyma

8、lstemcells；heartfunction；apoptosisofmyocardialcells；rat 前期研究表明,益氣活血復方芪丹通脈片含藥血清具有體外誘導骨髓間充質干細胞(MSCs)向內皮細胞分化的作用1。本實驗旨在探討芪丹通脈片協(xié)同MSCs移植可否增加局部微血管密度(MVD)及對急性心肌缺血大鼠心肌細胞凋亡、心功能的影響。 1實驗材料 1.1動物 2月齡SD大鼠3只(制備MSCs用),雄性,體質量(10020)g；健康成年SD大鼠16只,雄性,體質量(25020)g,中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學動物中心提供。 1.2藥物 芪丹通脈片浸膏干粉(黃芪30g,丹參30g,當歸15g,桂

9、枝10g,紅花30g,此制劑1g相當于原材藥2.86g),西京醫(yī)院藥劑科提供。 1.3主要儀器與試劑 小動物呼吸機、二氧化碳孵箱(HERAcell),激光共聚焦顯微鏡,percoll分離液(pharmacia公司),F12-DMEM培養(yǎng)基、進口胎牛血清(JIBCO公司),BrdU(pharmacia公司),小鼠抗BrdU單克隆抗體,小鼠抗大鼠CD31單克隆抗體,FITC標記的山羊抗小鼠二抗,HP5500超聲診斷儀,TUNNEL試劑盒(武漢博士德生物技術公司)。 2實驗方法 2.1分組 成年SD大鼠16只分為芪丹通脈片聯(lián)合移植組與單純移植組,造模前分別灌服等體積芪丹通脈片浸膏干粉溶劑(2g原藥材

10、/kg)及生理鹽水14d(醫(yī)藥學/臨床醫(yī)學論文 2.2骨髓間充質干細胞的分離、純化和培養(yǎng) 將3只幼齡SD大鼠斷頸處死,浸泡在75%乙醇中5min,取出后用無菌PBS沖洗鼠體至無乙醇,在超凈臺下無菌取下股骨、脛骨置于平皿中,更換器械及超凈臺,剔除周圍肌肉組織等,用PBS反復沖洗。剪去骨干兩頭的關節(jié)面,暴露骨髓腔,用7號針頭穿刺兩骨端,用5mL含10%FBS的F12-DMEM沖出骨髓入離心管,1500/min離心10min。棄上清,用F12-DMEM重懸細胞,輕輕疊加到新鮮配制的密度為1.073的percoll分離液上,2500r/min離心30min,收集界面層混濁液,用PBS洗滌2次。然后用F

11、12-DMEM培養(yǎng)液(含體積分數(shù)10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100g/mL鏈霉素)重懸細胞,按1106/mL的密度接種,37、5%飽和濕度的CO2孵箱培養(yǎng),5d后首次更換培養(yǎng)液,棄去未貼壁細胞,34d換液1次,接近融合的MSCs用含0.1mmol/LEDTA的0.25%胰酶室溫消化,按13比例傳代,傳至第3代。MSCs回植前48,換用含5mol/L5-BrdU的F12-DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。臨用前加入0.25%胰蛋白酶消化,離心、收集細胞,調整細胞密度備用。 2.3造模 2組大鼠于第15日,采用Olivette方法,結扎冠狀動脈建立急性心肌梗死模型。50mg/kg戊巴比妥腹腔麻醉,氣管

12、插管,呼吸機正壓輔助呼吸；開胸暴露心臟,以4-0無損傷線結扎左冠狀動脈前降支,造成左室前壁心肌梗死模型。 2.4骨髓間充質干細胞移植 2組大鼠于左冠狀動脈前降支結扎后1,直視下在梗死心肌周圍用微量注射器分4點植入標記5-BrdU的MSCs(5106個細胞/100L),每點25L。關胸,維持輔助呼吸至自主呼吸恢復,送回籠中飼養(yǎng)。 2.5超聲心動圖 移植后3h及移植后4周,乙醚麻醉大鼠后固定,左側胸部剃毛,經胸應用HP5500超聲診斷儀,探頭頻率12MHz。取乳頭肌水平左室短軸切面,分別于左室收縮末期(LVES)和左室舒張末期(LVED)在二維圖像上測量左室舒張末期前后徑(LVEDD)、左室收縮末

13、期前后徑(LVESD)、收縮末期室壁厚度(WTS)、舒張末期室壁厚度(WTD)、前壁室壁增厚率(AWTF)、后壁室壁增厚率(PWTF)。所有數(shù)值均由連續(xù)3個心動周期測量數(shù)據(jù)平均得出。根據(jù)測值計算左室短軸縮短率(FS)及室壁增厚率(WTF)。FS(%)(LVEDDLVESD)/LVEDD100；WTF(%)(WTS-WTD)/WTD100。 2.6心肌細胞凋亡檢測 于移植后4周股靜脈注射10%KCl處死大鼠,使心臟停于舒張期,開胸取出心臟,PBS經主動脈灌注沖洗,立即行冰凍切片,丙酮固定,用脫氧核苷酸轉移酶(TdT酶)介導的dUTP缺口末端標記法標記凋亡細胞核,具體操作同試劑盒說明,DAB顯色。

14、每個切片于光鏡下200倍放大,隨機選取5個視野,檢測陽性表達率(陽性核占總細胞核的百分比)作為細胞凋亡指數(shù)(apoptoticindex,AI)。免費論文下載中心 2.7缺血區(qū)微血管密度檢測 冰凍切片PBS沖洗兩遍,加入150抗CD31小鼠單抗,置于濕盒中4過夜,PBS洗滌后加150FITC標記的山羊抗小鼠IgG,37孵育50min,洗片后用伊文氏蘭復染,50%緩沖甘油封片。于熒光顯微鏡下觀察CD31陽性細胞,CD31陽性細胞胞漿呈綠色,毛細血管密度以每高倍鏡視野(400)CD31陽性數(shù)表示,每張切片隨機選取5個視野。 2.8統(tǒng)計學方法 所有數(shù)據(jù)采用xs表示,采用方差分析和t檢驗進行統(tǒng)計學處理

15、,P0.05有統(tǒng)計學意義。 3結果 3.1骨髓間充質干細胞變化 接種后的細胞24h可見較多圓形細胞懸浮在培養(yǎng)液中,48h可見貼壁細胞,較懸浮細胞體積大,大小較均一,核大多為圓形,位于細胞中央。89d后,部分細胞成梭形,個別成三角形。換液后57d基本融合鋪滿,至第3代,細胞呈長梭形集落樣分布,形態(tài)較均一。 3.22組大鼠心功能改變 2組大鼠造模后心電圖均出現(xiàn)T波高尖改變,聯(lián)合組有1只大鼠死于造模后的室顫,其余大鼠均存活。2組大鼠在移植后3h檢查M型心臟超聲均顯示：前壁運動幅基本消失。移植后4周聯(lián)合移植組M型心臟超聲顯示：左室前后壁運動幅度正常,運動時相基本一致。單純移植組4周后M型心臟超聲顯示：

16、前壁運動幅度基本正常,但其運動時相較正常后壁明顯延遲。2組移植后3h和移植后4周心功能檢測值比較見表1。表12組大鼠移植后3h及移植后4周心功能檢測值比較(略)注：與移植后3h比較,P0.05；與單純移植組比較,P0.05。3.32組大鼠移植后4周心肌細胞凋亡比較 TUNNEL染色結果顯示凋亡細胞胞核呈棕黃色,聯(lián)合移植組心肌缺血區(qū)心肌細胞AI為17.235.46,較MSCs單純移植組AI(24.979.68)明顯下降(P0.05)。 3.42組大鼠移植后4周心肌缺血區(qū)微血管密度檢測 400倍視野下,聯(lián)合移植組微血管密度即CD31陽性細胞24320.3,較單純移植組19712.6明顯增加(P0.

17、05)。 4討論 近年來研究發(fā)現(xiàn),通過冠脈或心肌局部注射將MSCs導入心肌缺血的微環(huán)境中,可以分化為血管內皮細胞(EC),促進局部血管新生,達到改善心肌缺血目的,從而成為心血管領域的研究熱點。新生血管的形成可降低梗死灶周邊肥大心肌細胞的凋亡,挽救有活力的心肌細胞,減少膠原沉著,改善心功能2。但由于MSCs在體內缺血微環(huán)境中的分化效率有限,因此,是否存在一種方法可以提高MSCs的分化效率,增加血管新生,提高療效呢？本實驗旨在觀察和探討應用芪丹通脈片聯(lián)合MSCs移植可否促進MSCs向血管內皮細胞分化,從而提高局部MVD,改善心功能,降低心肌細胞凋亡。研究結果發(fā)現(xiàn)：經MSCs移植后4周,急性心肌梗死大鼠的心功能較移植后3h明顯改善,而芪丹通脈片聯(lián)合移植組心功能改善更為明顯,且聯(lián)合移植組心肌細胞凋亡指數(shù)較單純移植組明顯降低,MVD明顯增加。表明芪丹通脈片具有協(xié)助MSCs移植治療急性心肌梗死、提高局部微血管密度、改善心功能、減少心肌細胞凋亡的作用,可望為臨床協(xié)助MSs移植增加療效提供一種安全、有效的治療手段。 【參考文獻】1FukudaK.Developmentofregenerativecard