溶血性鏈球菌制劑OK432聯(lián)合腫瘤凍融抗原誘導(dǎo)小鼠骨髓樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟

1、溶血性鏈球菌制劑OK432聯(lián)合腫瘤凍融抗原誘導(dǎo)小鼠骨髓樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟 10-11-16 10:10:00 作者：曾真， 倪秀雄， 袁編輯：studa20【摘要】 目的 探討溶血性鏈球菌制劑（OK432）聯(lián)合腫瘤凍融抗原誘導(dǎo)小鼠骨髓樹(shù)突狀細(xì)胞（DCs）成熟的作用,改進(jìn)體外誘導(dǎo)DCs成熟的方案,為后期制備臨床使用的抗腫瘤DCs疫苗提供新的技術(shù)路線。 方法 分離小鼠骨髓單核細(xì)胞（BMMCs）,并在含10%胎牛血清(FCS)、重組小鼠粒巨噬細(xì)胞集落刺激因子(rmGMCSF)、重組小鼠白細(xì)胞介素4(rmIL4)的培養(yǎng)體系中誘導(dǎo)培養(yǎng),部分加入OK432和/或腫瘤凍融抗原沖擊,光鏡和透射電鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)

2、,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面分子CD83和CD86的表達(dá)情況。 結(jié)果 經(jīng)OK432聯(lián)合腫瘤細(xì)胞凍融抗原沖擊的DCs形態(tài)學(xué)特征典型。腫瘤凍融抗原沖擊后,DCs表面CD83和CD86的表達(dá)上調(diào),OK432進(jìn)一步刺激后,CD83和CD86的表達(dá)率顯著升高。 結(jié)論 采用OK432聯(lián)合腫瘤凍融抗原誘導(dǎo)DCs成熟的方案相對(duì)簡(jiǎn)便；OK432能有效促進(jìn)腫瘤凍融抗原沖擊后的骨髓DCs進(jìn)一步成熟。 【關(guān)鍵詞】 樹(shù)突細(xì)胞 溶血性鏈球菌制劑 骨髓 抗原 腫瘤樹(shù)突狀細(xì)胞（dendritic cells,DCs）是目前所知體內(nèi)功能最強(qiáng)的抗原呈遞細(xì)胞,具有打破腫瘤免疫耐受并激發(fā)特異性腫瘤免疫而抑制腫瘤發(fā)展的能力。隨著DCs體外

3、培養(yǎng)擴(kuò)增技術(shù)的日益成熟,DCs腫瘤疫苗作為腫瘤治療的新方法,顯示了良好的抗腫瘤前景1。但要使DCs腫瘤疫苗真正廣泛應(yīng)用于臨床,其體外培養(yǎng)擴(kuò)增技術(shù)還需進(jìn)一步優(yōu)化。本實(shí)驗(yàn)采用鏈球菌制劑OK432聯(lián)合腫瘤細(xì)胞凍融抗原誘導(dǎo)小鼠髓源性DCs成熟,并從形態(tài)學(xué)、細(xì)胞表型方面對(duì)其進(jìn)行鑒定,為進(jìn)一步研究該DCs疫苗的體內(nèi)外抗瘤活性提供試驗(yàn)基礎(chǔ),改進(jìn)體外誘導(dǎo)DCs成熟的方案,為后期制備臨床使用的抗腫瘤DCs疫苗提供新的技術(shù)路線。1 材料與方法1.1 主要材料 小鼠前胃癌(mouse forestomach carcinoma,MFC)細(xì)胞(中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)）；PRMI 1640 干粉培養(yǎng)基（美國(guó)GIBICO公司）

4、；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；重組小鼠白細(xì)胞介素4（rmIL4,美國(guó)R&D公司）；重組小鼠粒巨噬細(xì)胞集落刺激因子（rmGMCSF,美國(guó)R&D公司）；PE標(biāo)記的大鼠抗小鼠CD86、CD83及PE標(biāo)記的同型IgG1（美國(guó)Biolegend公司）；OK432（山東魯抗制藥公司）；紅細(xì)胞裂解液(139.6 mmol/LNH4Cl,16.96 mmolL Tris,用1 molL HCl調(diào)pH至72,本室配制)。1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SPF級(jí)615小鼠,68周齡,體質(zhì)量1520 g大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,許可證號(hào)：SCXK(遼)20040017。1.3 方法1.3.1 制備小鼠前胃癌細(xì)

5、胞凍融抗原 常規(guī)培養(yǎng)MFC細(xì)胞,制成1107 mL-1的細(xì)胞懸液,8037 反復(fù)凍融4次,離心收集上清液,過(guò)濾,20 保存?zhèn)溆?2。1.3.2 獲取骨髓前體細(xì)胞 取615小鼠頸椎脫臼處死,無(wú)菌取雙側(cè)股骨和脛骨。去除附著的肌肉和結(jié)締組織,剪掉骨兩端,用PBS液沖洗骨髓腔,制成骨髓細(xì)胞懸液,400目尼龍網(wǎng)過(guò)濾,離心棄上清,110的體積比加入37 預(yù)溫的紅細(xì)胞裂解液,反復(fù)吹打混勻,室溫5 min,PBS離心洗滌2次,用含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培液調(diào)整細(xì)胞濃度為5106 mL-1,接種于6孔培板,培養(yǎng)孵育2 h,吸去懸浮細(xì)胞,所得的半貼壁細(xì)胞即骨髓單核細(xì)胞（bone marrow mo

6、nonuclear cells ,BMMCs)24。1.3.3 體外誘導(dǎo)分化骨髓DCs 將貼壁的BMMCs分為3組,置于含10%FCS、GMCSF（1 000 IU/mL）、IL4（500 IU/mL）的PRMI 1640完全培養(yǎng)液中,37 、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng),分別于第3,5天各全量換液1次并補(bǔ)加細(xì)胞因子,并將其中2組于培養(yǎng)第4天加入MFC細(xì)胞凍融抗原沖擊使BMDCs捕獲并處理抗原（按制備凍融抗原前的腫瘤細(xì)胞數(shù)量與DCs數(shù)量31的比例加入腫瘤抗原）16 h后換液,并給其中1組加入OK432 5 g/mL,繼續(xù)培養(yǎng)48 h,于培養(yǎng)第7天分別收集3組懸浮細(xì)胞2：BMDCs組

7、（GMCSF、IL4誘導(dǎo)但未經(jīng)抗原沖擊的DCs）；TLDCs組（經(jīng)GMCSF、IL4誘導(dǎo)及腫瘤凍融抗原沖擊的DCs）；OKDCs組（經(jīng)GMCSF、IL4誘導(dǎo)誘導(dǎo)及腫瘤抗原沖擊后加入OK432進(jìn)一步促進(jìn)其成熟的DCs）。1.3.4 細(xì)胞形態(tài)觀察 每日用倒置顯微鏡直接觀察細(xì)胞形態(tài)并拍攝照片。培養(yǎng)7 d后,收集各組DCs,3%戊二醛1.5%多聚甲醛前固定,1%鋨酸1.5%亞鐵氰化鉀后固定,酒精丙酮脫水,環(huán)氧樹(shù)脂618包埋劑包埋；超薄切片,醋酸鈾、檸檬酸鉛染色,透射電鏡觀察、攝影。1.3.5 細(xì)胞表型檢測(cè) 分別收集誘導(dǎo)前的BMMCs和培養(yǎng)第7天3組細(xì)胞,PBS緩沖液洗滌,調(diào)整細(xì)胞濃度2106mL-1,

8、每組細(xì)胞分成3份,分別加入直接熒光標(biāo)記抗體PECD83、PECD86及同型陰性照。4 避光孵育45 min,PBS洗滌,重新懸浮細(xì)胞,流式細(xì)胞儀分析104個(gè)細(xì)胞分布及抗原表達(dá)情況。1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)以xs表示。采用SPSS 11.5軟件包處理數(shù)據(jù)。單因素方差分析,SNKq檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行兩兩比較,P0.05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2 結(jié)果2.1 DCs形態(tài)2.1.1 光鏡觀察 BMMCs培養(yǎng)第1天,倒置顯微鏡下可見(jiàn)大量的細(xì)胞聚集成均勻散布的細(xì)胞集落,呈簇狀生長(zhǎng),形如葡萄串,細(xì)胞體積小,多為圓形,細(xì)胞無(wú)突起（圖1A）；第4天,細(xì)胞從集落中逐漸釋放出來(lái),半貼壁狀散在分布,體積逐漸增大,形狀不規(guī)則,

9、呈蝌蚪狀或梭形,有少量毛刺狀突起,即為未成熟DCs（圖1B）；加入腫瘤凍融抗原沖擊16 h后再給予OK432誘導(dǎo)48 h后即培養(yǎng)第7天,細(xì)胞集落消失,多數(shù)細(xì)胞懸浮,體積明顯增大,細(xì)胞質(zhì)豐富,表面有粗大樹(shù)突狀突起,即為成熟DCs（圖1C）。背景可見(jiàn)少量長(zhǎng)梭形細(xì)胞,為伸展的巨噬細(xì)胞。DCs：樹(shù)突狀細(xì)胞. A: 誘導(dǎo)培養(yǎng)第2天的DCs（200）； B:誘導(dǎo)培養(yǎng)第4天的DCs（200）；C:誘導(dǎo)培養(yǎng)第7天的DCs（400）圖1 光鏡下小鼠骨髓樹(shù)突狀細(xì)胞體外培養(yǎng)形態(tài)學(xué)變化（略）Fig 1 The development of dendritic cells from mouse bone marrow in vitro under optical microscope2.1.2 電鏡觀察 培養(yǎng)至第7天的未經(jīng)腫瘤凍融抗原沖擊的DCs, 細(xì)胞圓,形態(tài)較規(guī)則,表面突起少而短,呈丘狀或粗短指狀,細(xì)胞器不發(fā)達(dá),呈未成熟DCs形態(tài)；經(jīng)腫瘤凍融抗原沖擊后的DCs,形態(tài)不規(guī)則,表面突起逐漸增多、增長(zhǎng),細(xì)胞核不規(guī)則,呈偏位；經(jīng)OK432聯(lián)合腫瘤凍融抗原誘導(dǎo)的DCs表面有大量皺褶和細(xì)長(zhǎng)的分支樣突起,細(xì)胞質(zhì)含有豐富的線粒體和少量溶酶體,可見(jiàn)粗面和滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及高爾基體,細(xì)胞核大不規(guī)則,呈偏位（圖2）。2.2 細(xì)胞表型 貼壁的B