青霉素的生產(chǎn)工藝流程

1、武漢輕工大學(xué)武漢輕工大學(xué)青霉素的生產(chǎn)工藝青霉素的生產(chǎn)工藝主講人：張璐團(tuán)隊(duì)人員：周聰、吳昊、張杰、李春曉知識(shí)目標(biāo)：知識(shí)目標(biāo)： 掌握發(fā)酵生產(chǎn)青霉素的條件控掌握發(fā)酵生產(chǎn)青霉素的條件控制，及青霉素提取與精制的控制點(diǎn)制，及青霉素提取與精制的控制點(diǎn)。重點(diǎn)重點(diǎn):掌握掌握發(fā)酵生產(chǎn)青霉素的工藝流發(fā)酵生產(chǎn)青霉素的工藝流程程難點(diǎn)難點(diǎn):青霉素提取與精制的控制點(diǎn)青霉素提取與精制的控制點(diǎn)什么是青霉素什么是青霉素青霉素青霉素 又被稱為青霉素又被稱為青霉素G、青、青霉素鈉、芐青霉素鈉、青霉素霉素鈉、芐青霉素鈉、青霉素鉀、芐青霉素鉀等。青霉素是鉀、芐青霉素鉀等。青霉素是抗菌素的一種，能破壞細(xì)菌的抗菌素的一種，能破壞細(xì)菌的細(xì)胞壁

2、（革蘭氏陽(yáng)性菌）并在細(xì)胞壁（革蘭氏陽(yáng)性菌）并在細(xì)菌細(xì)胞的繁殖期起殺菌作用細(xì)菌細(xì)胞的繁殖期起殺菌作用的一類抗生素，是第一種能夠的一類抗生素，是第一種能夠治療人類疾病的抗生素。青霉治療人類疾病的抗生素。青霉素是素是-內(nèi)酰胺類抗生素的典型代內(nèi)酰胺類抗生素的典型代表。表。青霉素結(jié)構(gòu)青霉素結(jié)構(gòu)青霉素的理化性質(zhì)青霉素的理化性質(zhì)1、穩(wěn)定性：固體青霉素鹽的穩(wěn)定性與其含水量和純度有很大的關(guān)系；2、溶解度：青霉素游離酸在水中溶解度很小，易溶于有機(jī)溶劑如醋酸乙酯、苯、氯仿、丙酮和乙醚中，而其鉀鹽、鈉鹽易溶于水和甲醇，可溶于乙醇；3、降解反應(yīng)：青霉素是很不穩(wěn)定的化合物，遇酸堿或加熱易分解而失去活性，并發(fā)生分子重排。（

3、a）最早發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)生青霉素的 原始菌種是點(diǎn)青霉菌，生產(chǎn)能力 很低，不能滿足工業(yè)生產(chǎn)要求， 所以被淘汰?，F(xiàn)在主要采用的的 產(chǎn)黃青霉菌。（b）為了提高產(chǎn)黃青霉的青霉素產(chǎn)量 使用的誘變劑如：二環(huán)氧丁烷、 甲磺酸乙酯、乙烯亞胺、亞硝酸、 X射線等。 菌種：n產(chǎn)黃青霉：產(chǎn)黃青霉：Penicillium chrosogenumn深層培養(yǎng)深層培養(yǎng) 菌絲形態(tài)菌絲形態(tài)n菌落：菌落：平坦或皺褶，圓形。平坦或皺褶，圓形。n分生孢子：分生孢子：鏈狀；鏈狀； 顏色顏色絲狀菌球狀菌黃孢子絲狀菌綠孢子絲狀菌：發(fā)酵單位85000U/mL綠孢子球狀菌白孢子球狀菌：發(fā)酵單位高，對(duì)原材 料、設(shè)備要求高，提 煉收率低。青霉素發(fā)酵工藝青

4、霉素發(fā)酵工藝1.發(fā)酵工藝流程 孢子制備孢子制備1、將沙土孢子先在用甘油、葡萄糖、蛋白將沙土孢子先在用甘油、葡萄糖、蛋白胨組成的培養(yǎng)基進(jìn)行斜面培養(yǎng)，經(jīng)傳代活胨組成的培養(yǎng)基進(jìn)行斜面培養(yǎng)，經(jīng)傳代活化，化，得單菌落。得單菌落。2、再傳斜面，培養(yǎng)、再傳斜面，培養(yǎng)7天，天，制得斜面孢子。制得斜面孢子。3、再移植到優(yōu)質(zhì)小米或大、再移植到優(yōu)質(zhì)小米或大米固體培養(yǎng)基上，米固體培養(yǎng)基上，25C，相對(duì)濕度，相對(duì)濕度45%-50%，生長(zhǎng)，生長(zhǎng)7天，天，大米表面長(zhǎng)出明顯小菌落大米表面長(zhǎng)出明顯小菌落時(shí)要再振搖均勻，使菌絲在大米表面能均時(shí)要再振搖均勻，使菌絲在大米表面能均勻生長(zhǎng)，勻生長(zhǎng)，制得綠色小米孢子。制得綠色小米孢子。注

5、意注意：每每批孢子必需進(jìn)行嚴(yán)格搖瓶試驗(yàn)，測(cè)定效價(jià)批孢子必需進(jìn)行嚴(yán)格搖瓶試驗(yàn)，測(cè)定效價(jià)及檢查雜菌情況。斜面孢子和米孢子培及檢查雜菌情況。斜面孢子和米孢子培養(yǎng)要注意濕度控制養(yǎng)要注意濕度控制種子罐培養(yǎng)工藝種子罐培養(yǎng)工藝一級(jí)種子發(fā)酵：發(fā)芽罐，孢子萌發(fā)，形成菌絲。培養(yǎng)基：葡萄糖，玉米漿，碳酸鈣，玉米油 消沫劑等；接種量:200億孢子/t培養(yǎng)基空氣流量: 1：3（通氣量與發(fā)酵液體積比）（m3 / m3 min）；攪拌轉(zhuǎn)速:300-350r/min； 溫度：271 ； 時(shí)間: 40h。質(zhì)量：質(zhì)量：菌絲濃度達(dá)菌絲濃度達(dá)40%，菌絲形態(tài)正常，菌絲形態(tài)正常二級(jí)種子罐：二級(jí)種子罐：繁殖罐，大量繁殖。培養(yǎng)基：培養(yǎng)基：

6、葡萄糖、玉米漿、碳酸鈣，玉米油，消沫劑等；接種量：接種量：10；空氣流量：1:1-1.5 （m3 / m3 min）；攪拌轉(zhuǎn)速：250-280r/min；pH：自然；溫度：251；時(shí)間： 10-14h；質(zhì)量：質(zhì)量：菌絲濃度達(dá)菌絲濃度達(dá)40%，殘?zhí)牵瑲執(zhí)?.0%以下，菌以下，菌絲粗壯，絲粗壯，III期（脂肪粒，積累貯藏物），無(wú)期（脂肪粒，積累貯藏物），無(wú)雜菌，效價(jià)在雜菌，效價(jià)在700u/ml左右。左右。生產(chǎn)罐培養(yǎng)工藝生產(chǎn)罐培養(yǎng)工藝三級(jí)罐三級(jí)罐：生產(chǎn)罐；培養(yǎng)基培養(yǎng)基： 花生餅粉，葡萄糖，尿素，硝酸銨， 硫代硫酸鈉，苯乙酰胺，CaCO3, 玉米油, 硅油.培養(yǎng)基培養(yǎng)基 碳源青霉菌能利用多種糖，如：碳

7、源青霉菌能利用多種糖，如：葡萄糖、乳糖葡萄糖、乳糖。目前采用。目前采用淀粉水解糖，糖化液進(jìn)行流加。淀粉水解糖，糖化液進(jìn)行流加。 氮源可采用氮源可采用玉米漿玉米漿、花生餅粉、精制棉籽餅粉或麩皮粉等、花生餅粉、精制棉籽餅粉或麩皮粉等有機(jī)氮源，及氯化氨、硫酸氨、硝酸氨等無(wú)機(jī)氮源。有機(jī)氮源，及氯化氨、硫酸氨、硝酸氨等無(wú)機(jī)氮源。 前體為生物合成含有芐基基團(tuán)的青霉素前體為生物合成含有芐基基團(tuán)的青霉素G，需要在發(fā)酵中，需要在發(fā)酵中加入前體如加入前體如苯乙酸或苯乙酰胺。苯乙酸或苯乙酰胺。由于它們對(duì)青霉素有一定由于它們對(duì)青霉素有一定毒性，故一次加入量不能大于毒性，故一次加入量不能大于0.1%，并采用多次加入方，

8、并采用多次加入方式。式。 無(wú)機(jī)鹽包括無(wú)機(jī)鹽包括硫硫、磷、鈣、磷、鈣、鎂、鉀（前少后多，氮源轉(zhuǎn)為氨鎂、鉀（前少后多，氮源轉(zhuǎn)為氨基酸）基酸）等鹽類。等鹽類。鐵鐵離子對(duì)青霉素有毒害作用，應(yīng)嚴(yán)格控制離子對(duì)青霉素有毒害作用，應(yīng)嚴(yán)格控制發(fā)酵液中鐵含量在發(fā)酵液中鐵含量在30ug/mL以下。以下。溫度控制溫度控制適宜菌絲生長(zhǎng)溫度一般為適宜菌絲生長(zhǎng)溫度一般為27C，分泌青霉素分泌青霉素2020青霉素破壞少，周期很長(zhǎng)。青霉素破壞少，周期很長(zhǎng)。變溫控制，不同階段不同溫度。變溫控制，不同階段不同溫度。生長(zhǎng)階段生長(zhǎng)階段:較高溫度，縮短生長(zhǎng)時(shí)間；生產(chǎn)階段適較高溫度，縮短生長(zhǎng)時(shí)間；生產(chǎn)階段適當(dāng)降低溫度，以利于青霉素合成。當(dāng)

9、降低溫度，以利于青霉素合成。前期控制前期控制26左右，后期降溫控制左右，后期降溫控制22pH控制控制合成適宜pH6.46.6左右，避免超過(guò)7.0直接加酸或堿：自動(dòng)控制流加葡萄糖：速度取決于pH變化快慢。pH下降：補(bǔ)加CaCO3、通氨、尿素或提高通氣量pH上升：補(bǔ)加糖（補(bǔ)糖的控制可根據(jù)殘?zhí)橇考鞍l(fā)酵過(guò)程中的PH值或最好是根據(jù)排氣中CO2及O2量來(lái)控制。一般在殘?zhí)墙抵?.6%左右，PH值上升時(shí)開(kāi)始補(bǔ)糖。）、生理酸性物質(zhì)（硫酸銨、油脂）恒速補(bǔ)糖，用酸或堿控制方式 溶氧控制溶氧控制30飽和度，產(chǎn)率急劇下降；飽和度，產(chǎn)率急劇下降；10，造成不可逆的損害。，造成不可逆的損害。臨界溶氧濃度：臨界溶氧濃度：30

10、。通氣比：通氣比：1：0.81.5 。適宜的攪拌速度適宜的攪拌速度:保證氣液混合，提高溶氧保證氣液混合，提高溶氧各階段的供氧比較各階段的供氧比較一級(jí)種子階段二級(jí)種子階段發(fā)酵階段空氣流量（m3 / m3 min）1：31:1-1.51：0.81.5攪拌轉(zhuǎn)速（ r/min ）300-350250-280150-200消沫消沫天然油脂：玉米油；化學(xué)消沫劑：泡敵。天然油脂：玉米油；化學(xué)消沫劑：泡敵。前期前期:主間歇攪拌主間歇攪拌,少加油少加油中期中期:攪拌、加油、稍微降低通氣量（必要攪拌、加油、稍微降低通氣量（必要時(shí)），策略：少量多次，一次過(guò)多影響呼時(shí)），策略：少量多次，一次過(guò)多影響呼吸代謝。吸代謝。

11、后期后期:盡量少加消沫劑，可加水稀釋盡量少加消沫劑，可加水稀釋提煉工藝過(guò)程提煉工藝過(guò)程青霉素不穩(wěn)定，遇酸、堿、熱分解失活水溶液中不穩(wěn)定，非極性溶劑中穩(wěn)定易溶于有機(jī)溶劑，水中溶解度很小青霉素鹽很穩(wěn)定；降解產(chǎn)物具有致敏性防止降解，條件溫和、快速。預(yù)處理預(yù)處理青霉素的存在部位：發(fā)酵液濃度較低：1030Kg/M3含有大量雜質(zhì)：菌體細(xì)胞、核酸、雜蛋白質(zhì)、細(xì)胞壁多糖等、殘留的培養(yǎng)基、色素、鹽離子、代謝產(chǎn)物等目的：濃縮目的產(chǎn)物，去除大部分雜質(zhì)，改變發(fā)酵液的流變學(xué)特征，利于后續(xù)的分離純化過(guò)程。預(yù)處理:發(fā)酵液加少量絮凝劑沉淀蛋白過(guò)濾過(guò)濾鼓式真空過(guò)濾機(jī)過(guò)濾：草酸或黃血鹽一次濾液：pH6.2-7.2，略渾，棕黃或綠

12、色，蛋白質(zhì)含量0. 5-2.0%。板框式過(guò)濾機(jī)過(guò)濾：硫酸調(diào)節(jié)pH4.5-5.0，加入0.07%PPB（溴代十五烷吡啶），0.07%硅藻土為助慮劑。二次濾液：澄清透明，用于提取（收率90）溶劑萃取溶劑萃取原理：青霉素游離酸易溶于有機(jī)溶劑，原理：青霉素游離酸易溶于有機(jī)溶劑，而青霉素鹽易溶于水。而青霉素鹽易溶于水。萃取劑：青霉素分配系數(shù)高的有機(jī)溶劑。萃取劑：青霉素分配系數(shù)高的有機(jī)溶劑。工業(yè)上通常用：醋酸丁酯和醋酸戊酯。工業(yè)上通常用：醋酸丁酯和醋酸戊酯。除去蛋白質(zhì)：加除去蛋白質(zhì)：加0.05-0.1%乳化劑乳化劑PPB(溴代十五烷吡啶溴代十五烷吡啶)。萃?。狠腿。?3次。次。逆流萃取過(guò)程逆流萃取過(guò)程正相

13、萃?。核峄噍腿。核峄痯H1.8-2.0，濾液：醋酸丁，濾液：醋酸丁酯酯1：0.3，碟片式離心機(jī)分離（濃縮，碟片式離心機(jī)分離（濃縮1.5-2.1）反相萃取：反相萃?。簆H6.8-7.4（磷酸鹽、碳酸鹽緩（磷酸鹽、碳酸鹽緩沖液）。把青霉素從丁酯中提取到緩沖液沖液）。把青霉素從丁酯中提取到緩沖液中。中。反復(fù)萃取反復(fù)萃取23次，達(dá)到結(jié)晶要求。次，達(dá)到結(jié)晶要求。萃取條件：萃取條件：10下。萃取罐冷凍鹽水冷卻。下。萃取罐冷凍鹽水冷卻。混和器分離器混和器混和器分離器分離器第一級(jí)第二級(jí)第三級(jí) 圖 9-3 多級(jí)逆流萃?。ǚ?hào)說(shuō)明同圖9-1）L1L2 SL3R3F青霉素萃取方式 多級(jí)逆流萃取脫色脫色1.萃取液中萃取液中添加活性炭，添加活性炭，除去色素。除去色素。2.過(guò)濾，除過(guò)濾，除去活性炭