ST6GalI基因特異性siRNA對SW480細(xì)胞黏附和侵襲力的影響(精)

1、ST6Gal I 基因特異性 siRNA 對 SW480ffl胞黏附和侵襲力的影響作者： 苑天紅 , 李明遠(yuǎn) , 李婉宜 , 李虹 ,蔣忠華【關(guān)鍵詞】 siRNA;, 結(jié)腸腫瘤 ;, 唾液酸轉(zhuǎn)移酶 ;, 黏附 ;, 腫瘤侵襲力EffectofST6GalIsiRNAmediatedgene silencing on the adhesion and invasion ofSW480 cellsAbstractAIM: To study the effect of synthesized ST6Gal I specific siRNA on theadhesion and invasivenes

2、s of human colon carcinoma cell line SW480 with overexpression of ST6Gal I. METHODS: A double strand small interference RNA (siRNA)targeting ST6Gal I was designed and synthesized, and then transfected into SW480cells by lipofectmine 2000. SW480 cells were cultured and divided into 4 groups: blankcon

3、trol group, liposome control group, nonspecific siRNA group and ST6Gal I siRNAgroup. The expression of ST6Gal I mRNA was examined by RTPCR and the amountof a 2,6sialylation on the SW480 cell surface was detected by flow cytometry. Theadhesion and invasion of SW480 cells to extracellular matrix (ECM)

4、 were analyzed byusing CytoMatrixTM kit and cell invasion assay kit, respectively.RESULTS: After SW480 cells were transfected for 48 hours, the expression of ST6GalI mRNA in ST6Gal I siRNA group was significantly decreased compared with that inthe blank control group, liposome control group, and non

5、specific siRNA group(P0.05). After SW480 cells were transfectedfor 72 hours, theamount ofa2,6sialylationon cell surface, the adhesion and invasion of the cells in ST6Gal I siRNA group weremarkedly lower than those in the other 3 groups (P0.05). CONCLUSION: Thechemically synthesized specific siRNA ta

6、rgeting ST6Gal I can effectively inhibit theexpression ofST6GalI and reduce cell adhesion and invasion to ECM in SW480 cells. Our research isimportant for further study of antitumor treatment with RNA interference.KeywordssiRNA; colon neoplasm; sialyltransferase; adhesion; neoplasminvasion 摘 要目的: 探討

7、人a2,6 唾液酸轉(zhuǎn)移酶 (ST6Gal I) 小分子干擾RNA(siRNA 對 ST6Gal I 高表達(dá)的結(jié)腸癌 SW48(細(xì)胞株的黏附和侵襲力的影響。 方法 :設(shè)計(jì)并合成 ST6Gal I 靶向的 siRNA, 用脂質(zhì)體 Lipofectamine 2000 包裹后轉(zhuǎn)染 SW48C 細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對照組、脂質(zhì)體對照組、非特異性 siRNA 組和ST6Gal I siRNA 組,采用 RTPCRffl 定細(xì)胞中 ST6Gal I mRNA 表達(dá)水平,流 式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面a2,6 唾液酸含量，并分別用 CytoMatrixTM 細(xì)胞黏附試 劑盒及細(xì)胞侵襲分析試劑盒，檢測細(xì)胞對細(xì)胞外基質(zhì)（

8、ECM 黏附與侵襲力。結(jié) 果：與空白對照組、脂質(zhì)體對照組、 非特異性 siRNA 組相比,轉(zhuǎn)染 48 h 后,ST6Gal I siRNA 組細(xì)胞中 ST6Gal I mRNA 表達(dá)明顯下調(diào)；轉(zhuǎn)染 72 h 后,ST6Gal IsiRNA 組細(xì)胞表面a2,6 唾液酸的含量及細(xì)胞對 ECM 勺黏附和侵襲力 均明顯低于其他3 個(gè)對照組（P0.05）。結(jié)論：化學(xué)合成的靶向 ST6Gal I 的 siRNA 能夠下調(diào) SW48（細(xì)胞中 ST6Gal I 基因的表達(dá)，降低細(xì)胞對 ECM 勺黏附和 侵襲力。本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步研究應(yīng)用 RNA 干擾技術(shù)抗腫瘤治療奠定基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞siRNA;結(jié)腸腫瘤；唾液酸轉(zhuǎn)移酶

9、；黏附；腫瘤侵襲力結(jié)腸癌是人類最常見的惡性腫瘤之一 , 早期侵襲轉(zhuǎn)移是結(jié)腸癌患者死亡的 主要原因。腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與細(xì)胞表面糖復(fù)合物的異常表達(dá)特別是與糖復(fù)合物 末端的唾液酸化改變密切相關(guān)。a2,6 唾液酸轉(zhuǎn)移酶 （ST6Gal I） 可催化活化的 唾液酸以a2,6 糖苷鍵的形式連接到細(xì)胞膜表面的 N 乙酰乳糖胺上,成為腫瘤 細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix, ECM） 之間相互識別的重要受體 1 。有研究表明 , 某些腫瘤細(xì)胞如宮頸癌細(xì)胞、 乳腺癌細(xì)胞、 肝癌細(xì)胞、 結(jié)腸癌細(xì)胞、 胃癌細(xì)胞中 , ST6Gal I基因均高表達(dá) , 由此認(rèn)為該基因的高表 達(dá)是引起腫瘤高侵襲

10、力的主要原因之一 1-5。RNAf 擾（RNA interferenee, RNAi）技術(shù)是近年研究基因表達(dá)調(diào)控的熱點(diǎn)課題之一，在抗腫瘤和抗病毒等方面 均表現(xiàn)出高度特異性和有效性的抑制作用 6 。本研究中通過探討 ST6Gal I 靶 向的小分子干擾 RNA（small interferenee RNA, siRNA ）對結(jié)腸癌細(xì)胞表面唾 液酸化的抑制作用，以及降低癌細(xì)胞對 ECM 黏附和侵襲的作用，為抑制腫瘤轉(zhuǎn) 移探索新的治療方法。1 材料和方法1.1材料 SW480 細(xì)胞株購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。RPMI1640OptiMEM 培養(yǎng)基干粉購自美國 Gibieo 公司；Trizol 試劑

11、、 轉(zhuǎn)染劑脂質(zhì)體 Lipofeetamine 2000 購自美國 Invitrogen 公司；異硫氰酸熒光素 （FITC）標(biāo)記的接骨木凝集素（SNA 購自美國 Vector 公司；RTPCR 試劑盒購 自日本 TaKaRa公司；CytoMatrixTM 細(xì)胞黏附試劑盒及細(xì)胞侵襲分析試劑盒均 為美國 Chemieon 公司產(chǎn)品。1.2方法1.2.1 siRNA 的設(shè)計(jì)及合成根據(jù) GenBanl 提供的 ST6Gal I 基因序列（序列號：X_17247 ）,利用 Ambion 公司網(wǎng)站上交互式軟件在線設(shè)計(jì)了一對 siRNA。將其進(jìn)行 BLAST 分析，該 siRNA 僅與目的基因完全同源，無非特

12、異靶序 列。同時(shí)，設(shè)計(jì)一對非特異性 siRNA（錯(cuò)配 siRNA）作為無義對照。所有 siRNA 由 上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司化學(xué)合成（表 1 ）。1.2.2 引物的設(shè)計(jì)及合成 參照文獻(xiàn) 1 并用 primer premier 3.0 軟件在 線設(shè)計(jì)了一對擴(kuò)增 ST6Gal I 的引物，同時(shí)設(shè)計(jì)了管家基因Bactin 引物作為內(nèi) 參照（表 1）。表 1 ST6Gal I 干擾序列和 RTPCF 引物序列 略1.2.3SW480 細(xì)胞培養(yǎng) SW480 細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含 100 mL/L 小牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)液中,37C、50 mL/L CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；每 2 d 用 2.5 g

13、/L 胰 酶消化傳代,取對數(shù)生長期的 SW48C 細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。1.2.4siRNA 轉(zhuǎn)染將 3X105 個(gè)細(xì)胞/（孔？2 mL）接種于 6 孔培養(yǎng)板中,當(dāng)細(xì) 胞覆蓋達(dá) 60%80 時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染時(shí)用不含抗生素的 OptiMEM 培養(yǎng)液，將siRNALipofectamine 2000 復(fù)合體（復(fù)合體的配制及轉(zhuǎn)染程序按說明書操作） 加到培養(yǎng)板中,轉(zhuǎn)染體積為 500 卩 L, siRNAs 終濃度為 50 nmol/L,以非特異 性 siRNA 組（SW48C 細(xì)胞用對照 siRNALipofectamine 2000 復(fù)合體處理）、脂質(zhì)體組（SW480 細(xì)胞用等量脂質(zhì)體處理）、空白組（SW480 細(xì)胞用等量培養(yǎng)液處理）作為對照。每組設(shè) 3 個(gè)復(fù)孔 , 實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行 3 次。1.2.5RTPCF 檢測細(xì)胞中 ST6Gal I mRNA 的表達(dá)水平SW480 細(xì)胞被轉(zhuǎn)染 48 h 后，細(xì)胞總 RNA 提取用 Trizol 試劑，按照說明書方法進(jìn)行提取。將 mRN 反轉(zhuǎn)錄為穩(wěn)定的 cDNA,再進(jìn)行 PCF 反應(yīng),擴(kuò)增 ST6Gal I 和內(nèi)參照Bactin, 擴(kuò)增片段長度分別為 379 bp