輕工業(yè)微生物實驗指導書

1、編號：時間：2021年x月x日書山有路勤為徑，學海無涯苦作舟頁碼：第11頁 共11頁實驗一 培養(yǎng)基的制備與滅菌技術一、試驗原理馬鈴薯中含有淀粉、蛋白質、脂類及多種維生素經煮沸后可把這些營養(yǎng)成分從中溶出以供酵母和霉菌生長需要，加入葡萄糖或蔗糖以補充微生物所需的碳源。此培養(yǎng)基為半合成培養(yǎng)基。二、實驗目的：1、掌握培養(yǎng)基的制備方法，2、學會高壓蒸汽滅菌技術。三、實驗材料和儀器：1、馬鈴薯、葡萄糖（或蔗糖）、瓊脂。2、燒杯、漏斗、試管、三角瓶、量筒、玻璃棒、紗布、棉花、細繩、牛皮紙、試管架、培養(yǎng)皿。3、手提式高壓蒸汽滅菌鍋、天平、電爐。四、實驗方法與步驟：（1）選無芽、無腐爛的馬鈴薯、洗凈、削皮、稱4

2、0g切碎加水200ml,放入1000ml燒杯中煮沸0.5hr、冷卻用紗布過濾去渣。（2）在清液中加入4g葡萄糖溶解補水至200ml，此時到入一試管10ml。余下溶液加3.8g瓊脂加熱熔化。（3）試管分裝：取玻璃漏斗裝在漏斗架上，漏斗下連一橡膠管，與玻璃管嘴相接，橡皮管上夾一彈簧夾，培養(yǎng)基倒入漏斗，通過彈簧夾控制培養(yǎng)基的流量。（4）余下的培養(yǎng)基分裝在兩個250ml的三角瓶中。（5）高壓蒸汽滅菌：把溶解完的培養(yǎng)基用棉塞塞上并用牛皮紙把棉花包住，在121，0.1Mpa下滅菌20min即可，滅菌時要注意放凈閥氣。取出滅菌物品時一定要等到壓力降到零時打開滅菌鍋蓋。（6）斜面擺放：將分裝滅菌后的瓊脂培養(yǎng)基

3、試管置于水平放置的試管上，凝固后即成斜面。（7）培養(yǎng)皿培養(yǎng)基的傾倒：先用酒精棉球擦拭桌面及雙手,在靠近酒精燈火焰的上方把冷卻到45左右的培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿內，每只倒入15ml左右。注意：溫度太低培養(yǎng)基會凝固。五、思考題：1培養(yǎng)基配制好后為什么要滅菌？2蒸汽滅菌應注意幾個問題？為什么？實驗二 微生物接種和無菌操作技術一、實驗目的1、了解無菌操作在微生物接種過程中的重要性，掌握無菌操作的基本環(huán)節(jié)。2、掌握幾種常用微生物的接種方法，為微生物的形態(tài)觀察作準備。二、實驗材料1、菌種 （1）細菌 大腸桿菌（Escherichia coli），枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）,(2)酵母 釀

4、酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）,(3)霉菌 黑曲霉（Aspergillus niger）2、培養(yǎng)基（1）肉湯培養(yǎng)基 固體斜面培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)基，半固體培養(yǎng)基，固體培養(yǎng)基。（2）PDA培養(yǎng)基 液體培養(yǎng)基，斜面培養(yǎng)基，固體培養(yǎng)基。3、接種工具 接種針，接種鉤，接種環(huán)。4、酒精燈，標簽紙，火柴，鑷子，75%酒精棉球，試管架，電爐，鋁鍋，無菌平皿。三、實驗方法與步驟1、斜面接種 用接種環(huán)在肉湯斜面培養(yǎng)基上劃密波蜿蜒曲線接種大腸桿菌和枯草芽孢桿菌，在PDA培養(yǎng)基斜面上用劃直線和點接的方法分別接種酵母菌和霉菌。2、液體接種：用接種環(huán)在肉湯培養(yǎng)基液體中接種細菌，在PDA液體培養(yǎng)基

5、中接種酵母菌。液體接種時取一環(huán)菌苔，沿管壁輕輕擦下菌苔，塞上棉塞輕搖試管。3、穿刺接種：在肉湯培養(yǎng)基上接種細菌，在PDA培養(yǎng)基上接種酵母菌。4、平板接種：分別在不同的培養(yǎng)基平板上點接不同的菌種。四、結果記錄1、斜面接種（1）檢查斜面接種情況、繪制斜面生長草圖。（2）分析斜面接種好壞的原因（3）保留斜面、以便觀察形態(tài)時使用。2、液體接種觀察記錄細菌、酵母的液體培養(yǎng)特征，保留酵母液體培養(yǎng)液備用。3、穿刺接種（1）檢查穿刺接種效果，繪制草圖。（2）敘述不同微生物穿刺培養(yǎng)后的現(xiàn)象及原因。（3）分析穿刺接種好壞的原因。4、平板接種（1）檢查平板接種的生長狀況，有無污染（凡沒接種地方長出菌落均為染菌）。（

6、2）描述各個菌落的特征。實驗三 顯微鏡的使用、微生物觀察和菌體大小測定一、實驗原理 應月顯微鏡的成像原理，同時借助顯微鏡的鏡臺測微尺和目鏡測微尺，兩尺配合使用，進行測量和運算，得出細胞的大小。 鏡臺測微尺系一特制的載玻片（圖13），它的中央是一具有刻度的標尺，全長為1mm，共劃分為10大格，每一大格又分成10小格，每一小格長0.01mm，即10um。也有全長為2mm，共分200小格，每小格的長度不變。在標尺的外圍有一小黒環(huán)，以便找到標尺的位置。 圖13鏡臺測微尺 目鏡測微尺是放在目鏡內的一種標尺，它有固定式和移動式兩種類趔。固定式目鏡測微尺為一塊圓形玻璃片，直徑為2021mm，如圖14所示。在

7、它的上面刻有各種形式的標尺，有為直線式的（圖1一4A），有為網式的（圖14B）通常用以測量長度的標尺為直線式的，一般為5mm，分成5大格，每一大格分成10小格，共計50小格。也有用同樣長度分為100小格的。網式目鏡測微尺主要用以計算數(shù)目和測量物體的面積。在它上面刻有方格的網狀標尺。方格的大小和數(shù)目各有不同，有25、36和49格，也有的一個正方形大格中劃分100個方格，在中央的一個方格中再劃分25個小方格。ABCD 圖14目鏡測微尺 A.直線式 B.網式 C.移動式（外形） D.移動式（內部） 移動式目鏡測微尺基本上和直線式目鏡測微尺相似，所不同的是除了泣種固定的標尺外，還有可以移動位置的指示線

8、。它裝在一個特別的目鏡中右邊由一個能旋轉的小輪控制著，輪上有刻度，分成100格，該輪每旋轉一圈，目鏡內能移動的指示線就從標尺一端向另一端移動格。 顯微測量時，先用鏡臺測微尺標定目鏡測微尺每小格代表的長度，然后才能用目鏡微尺來測量細胞的長度。二、實驗目的：1、學會測微尺的使用和計算方法。2、掌握酵母菌細胞體積的測定方法三、實驗材料和儀器：1菌種 釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）上次實驗的液體培養(yǎng)物2蓋玻片、載玻片、顯微鏡、鏡臺測微尺、目鏡測微尺、酒精燈、生理鹽水、吸水紙。3擦鏡紙、濾紙條、鑷子、無菌吸管、酒精棉球。 四、實驗方法與步驟 測微尺的使用操作 1、卸下目鏡的

9、上透鏡將目鏡測微尺有刻度一面向下裝在回鏡鏡面上，再旋上目鏡上的透鏡。 2、將鏡臺測微尺有刻度的一面朝上放在載物臺上夾好，使測微尺刻度位于視野中央。調焦至能看清鏡臺測微尺的刻度。 3、小心移動鏡臺測微尺和目鏡測微尺（如目鏡測微尺刻度模糊，可轉動目鏡上透鏡進行調焦），使兩尺左邊的“0”點直線重合，然后由左向右找出兩尺另一次重復的直線（圖15）。 4、記錄兩條重合線間目鏡測微尺和鏡臺測微尺的格數(shù)。按下式計算目鏡測微尺每格的長度等于多少um 目鏡測微尺每格的長度（um）鏡臺測微尺的格數(shù)目鏡測微尺的格數(shù)X100123450.00.10.20.30.40.60.50.70.80.91.0圖l5 目鏡測微尺

10、的標定上，目鏡測微尺；下，鏡臺測微尺例如，圖15中，在低倍鏡下所標定的目鏡測微尺的全長（50格），等于鏡臺測微尺70格，則目鏡測微尺每小格代表的長度則為：目鏡測微尺每格的長度（um）7050X1014 取下鏡臺測微尺，換上要測量的玻片標本，用目鏡測微尺測量細胞長度的格數(shù)，乘以每格的um數(shù)，即為細胞的實際長度。 如用不同倍數(shù)的物鏡與目鏡時，就需重新計算，方法同前。 在測量時應注意將被測量的標本移到視野中心，因為在這個位置上鏡像最清晰像差也最小，為減少誤差在測量同一物體時，要重復3次以上，再取其平均值還需注意視野中的亮度應均勻一致，以免影響測量值的準確性。 根據長度測量結果可計算細胞的體積。公式如

11、下： 橢圓形V4ab2/3（a,b為長短軸的半徑） 圓球形V4r3/3（r為半徑）5、酵母菌大小的測定 （1）取下鏡臺測微尺，換上酵母菌水浸片。 （2）測量菌體的長軸和軸各占目鏡測微尺的格數(shù)，然后換算出菌體的實際長度。 （3）在同一標本上測量510個酵母細胞，取其平均植。6、酵母菌體積的測定 用顯微測微尺測量并換算出酵母菌的長軸和短軸的實際長度后，代入公式求出酵母菌的體積V。 五、實驗結果1、在低倍鏡下：目鏡測微尺（ ）格鏡臺測微尺（）格，目鏡測微尺每小格（ ）um;2、在高倍鏡下：目鏡測微尺（ ）格鏡臺測微尺（）格，目鏡測微尺每小格（ ）um。3、酵母細胞長=目鏡側微尺（ ）格=（ ）微米。

12、酵母細胞寬=目鏡側微尺（ ）格=（ ）微米。酵母菌細胞體積=（ ）um3。六、思考題1、為什么采用不同放大倍數(shù)目鏡和物鏡時，必須重新用鏡臺測微尺對目鏡測微尺進行標定？2、若目鏡不變，目鏡測微尺也不變，只改變物鏡，那么，目鏡測微尺每格所測量的酵母的實際長度（或寬度）是否相同？為什么？ 實驗四 酵母菌細胞計數(shù)法及酵母出芽率的測定一、實驗目的：1、了解血球計數(shù)板的構造和使用方法。2、學習并掌握利用血球計數(shù)板對酵母菌細胞數(shù)進行測量和酵母出芽率的測定。二、實驗材料和儀器： 1、菌種 釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）上次實驗的液體培養(yǎng)物2、蓋玻片、載玻片、顯微鏡、血球計數(shù)板、酒

13、精燈、濾紙條、無菌吸管、酒精棉球、擦鏡紙等。三、實驗方法與步驟： 1. 血球計數(shù)板的構造:測定微生物生長量的方法很多，對酵母來說有兩大類：總菌計數(shù)和活菌計數(shù)，分別稱為直接和間接法?？偩嫈?shù)是利用血球計數(shù)板在顯微鏡下直接計數(shù)，立即得到數(shù)值，是死細胞和活細胞的總和；活菌計數(shù)是計算活菌在平皿上形成的菌落數(shù)，費時較長。本實驗利用血球計數(shù)板對酵母直接計數(shù)，計數(shù)的同時統(tǒng)計出出芽率。血球計數(shù)板由四條平行槽而構成三個平臺，中間平臺較寬，并分為兩部分，每部分均刻有長和寬各1mm的方格網，中間平臺下陷0.1mm，故蓋上蓋玻片后計數(shù)室的體積為0.1mm3。常用血球計數(shù)板有兩種規(guī)格。一種16x25型，稱為麥氏血球計數(shù)

14、板，共有16個大格，每個大格又分為25個小格；另一種是25x16型，稱為希里格式血球計數(shù)板，共25個大格，每一大格又分為16個小格。無論 是哪一種血球計數(shù)板，都有一共同特點，即計數(shù)室的小格數(shù)相同，均為400個。其結構見下圖。0.01mm1/400mm2 XB-K-25計數(shù)板蓋玻片中央平臺2.酵母菌細胞計數(shù)：(1).檢查血球計數(shù)板是否有雜質和菌體，若有用脫脂棉蘸取95%酒精輕輕擦洗計數(shù)板的計數(shù)室，用蒸餾水沖洗計數(shù)板，用濾紙吸干其上水分，勿用火烤，最后用擦鏡紙揩干凈。(2).樣品稀釋：稀釋的目的在于便于計數(shù)，稀釋要求每小格內45個細胞，一般稀釋10倍。（3）加樣：先將蓋玻片置于計數(shù)室上，用吸管吸取

15、一滴稀釋好的菌液滴于蓋玻片邊緣，讓菌液自行滲入，多余的菌液用濾紙吸去，稍待片刻，待酵母細胞全部沉降到計數(shù)室底部在進行計數(shù)。(4).計數(shù) 將加好樣品的計數(shù)板放到顯微鏡載物臺中央，按下列步驟尋找計數(shù)室并計數(shù)。 找計數(shù)室 先用低倍物鏡尋找到大方格網位置。尋找時，顯微鏡的光圈要適當縮小，使視野偏暗，然后順著大方格移動計數(shù)板，使計數(shù)室位于視野中間。 轉換高倍鏡 轉至高倍物鏡后，適當調節(jié)光亮度，使菌體和計數(shù)室線條清晰，然后將計數(shù)室一角的小格移至視野中。 計數(shù) 16x25型 取左上、右上、左下、右下四大格共100小格內的細胞逐一進行計數(shù)； 25x16型 取左上、右上、左下、右下和中間五大格共80小格進行計數(shù)

16、，計數(shù)時遇到位于大格線上的酵母菌時，只計大格上方及右方線上的細胞（或只計下方及左方線上的細胞），將細胞數(shù)填入格中 對每個樣品重復三次，取平均值，計算酵母菌細胞數(shù)。（5）計算公式：25x16: 細胞數(shù)/ml=(80小格細胞總數(shù)÷80)x400x10x1000x稀釋倍數(shù)16x25: 細胞數(shù)/ml=（100小格細胞總數(shù)÷100）x400x10x1000x稀釋倍數(shù) (6) 清洗 計數(shù)板使用完畢后，用蒸餾水沖洗，絕不能用硬物洗刷，洗后待其自行晾干或用濾紙吸干，最后用擦鏡紙揩干凈。若為病原菌，則浸泡在5%石炭酸溶液中消毒后再清洗。3.酵母出芽率的測定：（1） 同上步驟數(shù)出酵母的出芽數(shù)并

17、填在上面表格中（一般需平行計數(shù)三次）。（2）觀察酵母菌出芽率時，遇到芽體大于細胞本身50%時不作為芽體計數(shù)，而作為酵母數(shù)計數(shù)。（3）計算公式：酵母出芽率=（芽體數(shù)÷酵母菌細胞總數(shù)）x100%四、 實驗結果細胞總數(shù)測定表格：計數(shù)次數(shù)各大格中的細胞數(shù)大格中細胞總數(shù)稀釋倍 數(shù)細胞濃度（個/ml）芽體數(shù)左上 右上 右下 左下 中間第一次第二次第三次平均值三次測定結果：每毫升菌液中酵母細胞數(shù)平均值_。酵母細胞出芽率的測定計算次數(shù)總酵母細胞數(shù)芽體數(shù)出芽率（%）第一次第二次第三次 三次測定結果平均值：出芽率_%五、思考題：1、試述計數(shù)板的計數(shù)原理。為什么用兩種不同規(guī)格的計數(shù)板來計數(shù)同一樣品，結果是

18、一樣的？2、試分析酵母計數(shù)時應注意的問題和影響計數(shù)準確的原因。應如何盡量減少誤差，力求準確？實驗五 微生物的分離技術一、實驗原理 枯草芽孢桿菌的多數(shù)種都能產生大量的淀粉酶、蛋白酶，因此比較容易分離得到。目前市場上銷售的細菌淀粉酶、蛋白酶就是利用枯草芽孢桿菌生產的，所以它是重要的工業(yè)用菌之一。 由于芽孢具有較強的抗高熱能力，分離純化時可以采用熱處理的方法。七原理是，通過高溫加熱處理，殺死其中所有不生成芽孢的菌類，在培養(yǎng)過程中，使芽孢得到很好得富集。利用該菌產酶的特性，選擇分別以淀粉、酪蛋白為主要碳源的分離培養(yǎng)基。因酶的水解作用會使菌落周圍均出現(xiàn)清晰的透明圈。根據透明圈的直徑（C） 與菌落直徑（H

19、）之比可初步鑒定酶活力，即C/H比值越大，酶活力越高，進而篩選出優(yōu)良的生產用菌。 二、實驗目的學習并掌握枯草芽孢桿菌的分離純化技術三、實驗材料 1.樣品 含有機質較豐富的土壤。 2.培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，淀粉培養(yǎng)基，酪素培養(yǎng)基。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(150ml)：牛肉膏0.5，蛋白胨1，NaCl 0.5，pH7.27.4，121滅菌20min淀粉培養(yǎng)基(60ml)：牛肉膏0.5，蛋白胨0.5，NaCl0.5，可溶性淀粉2，瓊脂1.82。pH7.2，121滅菌30min酪素培養(yǎng)基(60ml)：磷酸二氫鉀0.036,七水硫酸鎂0.05，氯化鋅0.0014，七水磷酸氫二鈉0.107，NaCl0.

20、016，氯化鈣0.0002，硫酸亞鐵0.0002，酪素0.4，瓊脂2。pH值6.57.0，121滅菌20min。 3.試劑 0.02mol/l碘液，無菌水。 4.儀器 平面皿，吸管，三角瓶，無菌信封，無菌紗布，玻璃珠，搖床，涂布器。四、實驗方法與步驟 1.采樣 到園田用無菌小鏟采集離地面515cm深處的土壤若干，裝入無菌信封中，記錄時間、地點、植被和環(huán)境情況。 2. 分離 取土樣1g于250ml無菌三角瓶中，內加99ml無菌水及數(shù)粒無菌玻璃珠，置搖床上振蕩510分鐘，用無菌紗布過濾收集濾液。 3. 富集培養(yǎng) 取5ml濾液接于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液中（250ml三角瓶中裝有150ml培養(yǎng)液），置入8

21、090水浴中，加熱1015分鐘，記錄處理時間。然后30振蕩培養(yǎng)24小時，鏡檢。4. 傾注分離 將培養(yǎng)液再經一次熱處理后，以10倍稀釋法適當稀釋，取最后三個稀釋度的稀釋液各1ml于無菌平皿中，每稀釋度平行兩個皿。5. 融化淀粉瓊脂培養(yǎng)基與酪素瓊脂培養(yǎng)基，冷卻至50傾入上述各皿，輕輕搖勻，凝固后30培養(yǎng)2448小時。6.挑菌落 蛋白酶菌株 可直接觀察在酪素平板上菌落周圍所形成的透明圈，挑C/H比值大的接入斜面培養(yǎng)基，培養(yǎng)備用。 淀粉酶菌株 可取0.02mol/l碘液滴加在淀粉平板中的菌落周圍，觀察形成透明圈的結果。挑C/H比值大的接入斜面培基，培養(yǎng)備用。7.純種鑒定 染色后，在顯微鏡下觀察，利用細

22、胞形態(tài)及菌落形態(tài)進行鑒別。8.純化 將選定的菌株，采用平板分離純化法。五、思考題 1、仔細分析以上菌種篩選和純化步聚試述菌種分離成功的關鍵因素。 2、采用以上方法是否能夠分離篩選出青霉素抗性菌。實驗六 微生物染色（或發(fā)酵實驗）微生物細胞含水量大，對光線的吸收和反射與水溶液對光線的吸收和反射差別較小，與背景沒有明顯的明暗差別，因此，對微生物的觀察除觀察活體微生物的運動性和直接計算菌體數(shù)外，絕大多數(shù)情況下都必須經過染色，才能在顯微鏡下進行觀察。但在染色和制片過程中，微生物的形態(tài)和結構均發(fā)生一定程度的改變，不能完全代表其生活細胞的真實情況。在實際操作中要根據觀察目的不同，選用不同的染色和制片方法。

23、一、染色的基本原理微生物染色的基本原理，是借助于物理因素（細胞和細胞質對染料的毛細現(xiàn)象、滲透、吸附作用等）和化學因素（細胞物質和染料性質不同而發(fā)生的各種化學反應）對微生物作用來進行的。如呈酸性的細胞核物質易于被堿性染料染色。但是，要使酸性物質染上酸性染料，必須改變它們的化學形式，才有利于吸附作用的發(fā)生。相反堿性染料也如此。細菌的等電點較低，pH25之間，在中性、堿性或弱酸性溶液中，菌體蛋白質電離后帶負電荷；堿性染料電離時帶正電荷，因此，在細菌染色時常用堿性染料進行染色。影響染色的因素：菌體細胞的構造、外膜的通透性、培養(yǎng)基的組成、菌齡、染色液中的電介質含量和pH、溫度、藥物的作用等。二、染料及種

24、類（一）染料的性質染料大多是一種含有苯環(huán)的機化合物，能使其它物質牢固地著色。大都有苯環(huán)、發(fā)色基團（色基、呈色團）和助色基團（或作用基團）組成。若苯環(huán)上只連接發(fā)色基團，它雖然能呈色，但不能作為染料，因為它不能電離，與細胞的親和力差，與細胞的結合不牢固，用水一沖便可除去。有了助色基團，就具有了能夠電離的性質，能夠和適當?shù)奈镔|結合為鹽類。帶有正或負電荷的染料離子就能與細胞牢固地結合，使其呈色，所以苯環(huán)必須連接呈色和助色兩個基團后才能作為染料使用。顏色是發(fā)色基團所致，染色性則由助色基團決定。（二）染料的種類根據染料電離后染料離子帶電荷的性質，分為酸性、堿性、中性（復合）和單純染料四大類。1、酸性染料：

25、電離后染料粒子帶負電，可與堿性物質結合成鹽。如伊紅、剛果紅、藻紅、苯胺黑、苦味酸和酸性復紅等。2、堿性染料：電離后染料粒子帶正電，它們與酸性物質結合成鹽。如美藍、結晶紫、堿性復紅、番紅、孔雀綠和甲基紫等。2、中性（復合）染料：酸性染料與堿性染料的結合叫中性（復合）染料。如瑞脫氏染料和基姆薩氏染料等。三、制片與染色（一）制片在干凈的載玻片上滴一滴蒸餾水或無菌水，用接種工具進行無菌操作，取少許培養(yǎng)物，置于水滴中做成懸液并涂成直徑約1厘米的薄層。也可在玻片的另一端加一滴水對第一次的懸液進行稀釋使菌體分布均勻減少重疊，否則會使染料大面積堆積，不利于觀察。（二）干燥涂片最好是使其自然干燥，也可手持載玻片

26、菌體面向上在酒精燈的火焰高處微微加熱，以防標本烤枯而使菌體變形。（三）固定采用高溫固定，即手持載玻片快速從在酒精燈火焰外層來回通過3-4次，約2-3秒鐘，不斷用以載玻片接觸皮膚，溫度不超過60，待冷卻后，進行染色。如果觀察的微生物不適宜采用此法應采用化學方法固定。（四）染色采用合適的染色劑把固定后的標本全部浸在染色液中進行染色1-3分鐘之間。（五）水洗用細小的水流洗掉多余的染料，獲得清晰的視野以利于觀察。（六）干燥將洗干凈的標本晾干或用吸水紙吸取多余的水，烘干后備用。一、實驗原理革蘭氏染色法是1884年由丹麥醫(yī)生Gram創(chuàng)立的一種重要的細菌鑒別方法。其機理是利用G+和G-菌細胞壁的組成成分和結構的的不同。G-的細胞壁中含有較多的類脂質和較少的肽聚糖。當用乙醇或丙酮脫色時，類脂質被溶解，增加了壁的通透性是染料的復合物易于滲出，細胞脫色，復染后呈現(xiàn)出復染的染料顏色。G+的肽聚糖含量高，類脂質少，乙醇或丙酮洗脫時，肽聚糖層的孔徑變小，通透