westernblot失敗經(jīng)驗(yàn)總結(jié)

1、westernblot失敗經(jīng)驗(yàn)總結(jié)1我做了很久的WB,最大的一個(gè)難點(diǎn)感覺(jué)在于樣品制備上！蛋白的降解有些時(shí)候是你想象不到的，可能出奇的糟糕，也可能完全沒(méi)事如果單獨(dú)做WB的話，感覺(jué)以“快速?gòu)氐琢呀?，先變性后保存”的原則比較有效，盡量選擇足夠強(qiáng)的裂解液，甚至直接給loadingbuffer裂解，然后取出部分蛋白定量，其余加入loadingbufferlOO度充分變性，再分裝保存。有些時(shí)候比蛋白酶抑制劑更有效。另一個(gè)感覺(jué)就是樣品中目的蛋白的量，限于WB的檢測(cè)下限問(wèn)題，一般目的蛋白量最好別低于1ng（雖然ECL法下限是O.lng，即lOOpg），最好在10ng以上為好。這就要求在做WB之前必須充分考慮目

2、的蛋白的可能豐度，最好充分的準(zhǔn)備工作然后再設(shè)計(jì)細(xì)胞量或者組織量，千萬(wàn)別把樣品搞稀了，否則就不好辦了。最后，還是多看文獻(xiàn)，在做某個(gè)蛋白之前最好看看別人是如何做的，有什么特殊要求，內(nèi)參如何選等等。westernblot失敗經(jīng)驗(yàn)總結(jié)2我就跑膠和轉(zhuǎn)膜談一點(diǎn)兒自己的體會(huì)1、跑膠電泳Buffer重復(fù)利用的時(shí)候要注意，不能混濁，有時(shí)候能用個(gè)34次，有時(shí)候第二次都不行了，事先前預(yù)電泳一下，看看氣泡的均勻度；Buffer一定要淹過(guò)梳子孔，否則就會(huì)發(fā)現(xiàn)今天的蛋白不會(huì)跑；跑的時(shí)候先用低電壓跑過(guò)濃縮膠，再換高電壓跑分離膠，不要追求速度，慢慢跑條帶會(huì)分離的更好，特別是對(duì)于高分子量的目的蛋白；2、轉(zhuǎn)膜我用的是濕轉(zhuǎn)，Buf

3、fer一定要預(yù)冷，最好提前一天配好放4度；濾紙不要大過(guò)PVDF膜,防止短路；膠在負(fù)極，膜靠近正極，放入Tank前檢查一遍會(huì)使你免以體會(huì)放反的痛心疾首；膜要標(biāo)記好正反面；轉(zhuǎn)膜過(guò)程中，經(jīng)常過(guò)去看看，防止意外，如電泳儀接觸不好。WESTERNBLOTTING心得i.總蛋白提?。òぃ麧{，胞核）：組織勻漿后,15000g,4度，20分鐘后，取上清.Buffer:NP40750ul,脫氧膽酸鈉0.5克，SDS0.1克，力口1*PBS至100ml.再加入PMSF（7.4mg/ml）0.1ml.（現(xiàn)用現(xiàn)加）7.4mg/mlPMSP異丙醇溶液：取AmgPMSF加A/7.4ml異丙醇工廠-20度儲(chǔ)存2組織膜蛋

4、白提取：所在操作冰上進(jìn)行1）取組織，用PBS沖洗干凈組織上的血液.加入10mlBufferA,用剪刀盡可能剪碎組織,于冰上充分勻漿。每次30秒,重復(fù)3-5次.（2）離心機(jī)lOOOrpm,4C離心lOmin后，所得上清液轉(zhuǎn)入超速離心管。（去掉大塊組織及結(jié)締組織）（3）lOOOOOg,4C離心lhr,棄去上清（此為胞漿蛋白，若只提取胞漿蛋白，可用lOOOOrpm,4度,30分鐘離心，取上清即可）。沉淀用適量的BufferB重懸，4度過(guò)夜后，分裝至EP管，Eppendorf臺(tái)式離心機(jī)lOOOOrpm，4C離心3Omin。（4）收集所得上清液即為膜組份。BufferA：0.32M蔗糖，5mMTris-

5、HCl（PH7.5），120mMKC1,lmMEDTA,lmMEGTA,0.2mMPMSF,1ug/mlLeupeptin,1ug/mlPepstatinA,1ug/mlAprotinin。冰上預(yù)冷。BufferB20mMHEPES（PH7.5），l0%甘油，2%TritonX-l00,lmMEDTA,lmMEGTA,0.2mM，PMSF,1ug/mlLeupeptin,1ug/mlPepstatinA,1ug/mlAprotinin。冰上預(yù)冷。所得蛋白分裝EP管（每管約50ul）,取一管測(cè)蛋白濃度，其它放入-70度深凍冰箱保存。如果要定量的話，最好能立即根據(jù)濃度，加入上樣緩沖，煮沸，4度保存

6、。反復(fù)凍融蛋白會(huì)降解，濃度不準(zhǔn)?？捡R斯亮蘭G250測(cè)蛋白濃度：考馬斯亮蘭G250配方：G2500.4克,95%乙醇100ml,85%磷酸200ml,加水至2000ml,過(guò)濾后使用。BSA標(biāo)準(zhǔn)液：0.5mg/mlBSA,雙蒸水配制。配制標(biāo)準(zhǔn)液（濃度分別為0，10，20，30，40，50ug/ul）：1234536G2503ml3ml3ml3ml3ml3ml0.5mg/mlBSA20ul40ul60ul80ul100ulddH2O100ul80ul60ul40ul20ul待測(cè)蛋白配液：每管3mlG250,2ul樣品，98ulddH2O。（若加入樣品后，液體沒(méi)有變藍(lán)色，則可再加2ul樣品，ddH2O

7、減為96ul,標(biāo)準(zhǔn)液濃度可適當(dāng)擴(kuò)大。）紫外分光光度計(jì)，595nm,用1號(hào)管調(diào)零，制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)方程及R值（R值應(yīng)大于0.99,否則操作誤差較大），測(cè)量待測(cè)蛋白OD值，算出蛋白濃度。（若加入2ul樣品，則濃度值需除2,方為真正濃度；若加4ul樣品，則除4）聚丙烯酰胺電泳：1.自來(lái)水，洗滌劑清洗玻璃板，用ddH2O沖洗干凈，立放于盒子內(nèi)，60度烤箱烘干備用。2配膠：凝膠儲(chǔ)備液（30%Acr/Bise）：丙烯酰胺29克，雙體甲叉雙丙烯酰胺1克，加水至100ml。（有說(shuō)要棕色瓶保存，3個(gè)月?lián)Q新的，30%的丙烯酰胺如有沉淀，最好棄掉）10%APS：0.1克過(guò)硫酸銨，加ddH2O至1ml.（4度保存,

8、一周內(nèi)使用），本人都是配新鮮的用。10%SDS:1克SDS,10mlddH2O.（不溶時(shí),可加熱50度左右助溶.）TEMED:原液即可.0.5MTris-HCl（PH6.8）；1.5MTris-HCl（PH8.8）:9.0855克Tris,加入ddH2O溶解后，用HCL調(diào)PH至8.8,力口ddH2O到50ML配膠的濃度和方法書(shū)上都有，不詳細(xì)說(shuō)了！本人做的是70KD和17KD的分子量，分別配了10%和12%的分離膠，4%的濃縮膠。搖動(dòng)溶液充分混合（不要過(guò)于劇烈以免引入過(guò)多地氧氣）灌入2/3的分離膠后（估計(jì)距梳子底1CM）應(yīng)立即用ddH2O封膠。等到能看清水和膠的分界線，則可配濃縮膠。用面巾紙吸干

9、水后，注入濃縮膠，至頂。插入梳子，不要有氣泡。藍(lán)色字體是從別人貼子上看到的這些小孔的孔徑隨“雙丙烯酰胺丙烯酰胺”比率的增加而變小，比率接近1：20時(shí)孔徑達(dá)到最小值。SDS聚丙烯酰胺凝膠大多按“雙丙烯酰胺丙烯酰胺”為1：29配制，試驗(yàn)表明它能分離大小相差只有3%的蛋白質(zhì)。分離膠及濃縮膠均可事先配好（除AP及TEMED外），過(guò)濾后作為儲(chǔ)存液避光存放于4C，可至少存放1個(gè)月，臨用前取出室溫平衡（否則凝膠過(guò)程產(chǎn)生的熱量會(huì)使低溫時(shí)溶解于儲(chǔ)存液中的氣體析出而導(dǎo)致氣泡，有條件者可真空抽吸3分鐘），加入10%AP（0.70.8:100,分離膠濃度越高AP濃度越低，15%的分離膠可用到0.5:100）及TEME

10、D（分離膠用0.4:1000,15%的可用至U0.3:1000，濃縮膠用0.8：1000）PAGE配膠的試劑和配方比例對(duì)電泳結(jié)果的質(zhì)量當(dāng)然有決定性的影響，這個(gè)配膠的比例，在分子克隆上有詳細(xì)的論述。容易忽視的問(wèn)題主要在于過(guò)硫酸銨（AP）定要新鮮一一最好用小指管配AP（寫(xiě)日期）保存在-20度，超過(guò)2周的AP扔掉算了，或者已經(jīng)反復(fù)打開(kāi)使用多次的AP都別用。膠濃度10%時(shí)可用0.1%的SDS封，濃度10%時(shí)用水飽和的異丁醇或異戊醇，也可以用0.1%的SDS），封膠后切記，勿動(dòng)。如用醇封膠需用大量清水及ddH2O沖洗干凈，然后加少量0.1%的SDS，目的是通過(guò)降低張力清除殘留水滴。等濃縮膠凝的時(shí)間，就可

11、以配蛋白了。按照想要的濃度加入LOADINGBUFFER配制。本人按每孔總體積20ul,終濃度1*RSB，含50ug蛋白混合樣品，不足的體積用1*PBS補(bǔ)足。短暫離心后，沸水中煮5分鐘，放室溫，用時(shí)再短暫離心。125ug例如.50ug/20ul,做2.5孑L,即50ul，蛋白濃度1033ug/ul1391ug/ul1487ug/ul1903ug/ul所需體積12.1ul9ul8.4ul6.6ul5*RSB10ul10ul10ul10ul1*PBS27.9ul31ul31.6ul33.4ul5*RSB:1.89克Tris-HCL（PH6.8）,5克SDS,0.125克溴酚藍(lán),25ML甘油.（很粘

12、稠）Beta-巰基乙醇用時(shí)現(xiàn)加，按25%比例.10*PBS:Nacl4.25克,Na2HPO4.12H2O15.4g,NaH2PO42H2O1.4g,調(diào)PH到7.2-7.4，加ddH2O到500ML約30分鐘左右,取下梳子,將膠板放入電泳槽內(nèi),加入1*電泳緩沖液,沖洗加樣孔.微量進(jìn)樣器逐個(gè)加樣,空泳道加入1*RSB.兩膠板之間的電泳液要滿.接好正負(fù)極,開(kāi)始電泳,可先小電壓,約50V，大約跑過(guò)濃縮膠后再改為100V.觀察MARKER的情況，適時(shí)終止電泳.建議說(shuō)目的帶要跑到分離膠的2/3處比較好,但本人一直都在上1/3處,結(jié)果也還可以.預(yù)染MARKER很重要，開(kāi)始選了一個(gè)國(guó)產(chǎn)的，總是跑不好，后來(lái)?yè)Q

13、成NEB的，效果很好,而且也不貴,范圍也比較廣,把我要的7.,42.17全都包括在內(nèi).如果濃縮膠跑的好的話，幾個(gè)孔的蛋白會(huì)跑成一條直線.注意加樣時(shí)間要盡量短，以免樣品擴(kuò)散，為避免邊緣效應(yīng)，可在未加樣的孔中加入等量的樣品緩沖液未聚合的丙烯酰胺具有神經(jīng)毒性,操作時(shí)應(yīng)該戴手套防護(hù).梳子插入濃縮膠時(shí),應(yīng)確保沒(méi)有氣泡,可將梳子稍微傾斜插入以減少氣泡的產(chǎn)生,梳子拔出來(lái)時(shí)應(yīng)該小心,不要破壞加樣孔,如有加樣孔上的凝膠歪斜可用枕頭插入加樣孔中糾正但要避免枕頭刺入膠內(nèi).10*電泳緩沖液：Tris7.58克，甘氨酸36克，SDS2.5克，ddH2O定容到250ML.不好溶,可用攪拌器.可重復(fù)使用，每次加一些新的進(jìn)去

14、.但本人每次都是配新的，也不麻煩.轉(zhuǎn)膜跑完電泳后,取出膠，可以一塊做考馬思亮藍(lán)R250染色約30分鐘，脫色液脫色，看看蛋白條帶跑的如何，上樣量如何.另一塊可用做轉(zhuǎn)膜.放入轉(zhuǎn)移緩沖液中搖30分鐘左右（有次著急只晃了10分鐘，結(jié)果也挺好的）。開(kāi)始用的PVDF膜,0.45um，用國(guó)產(chǎn)的MARKER后，總是染的不清楚，而且無(wú)論時(shí)間長(zhǎng)短，最后一塊濾紙都會(huì)被染色.后來(lái)?yè)Q了NEB后,PVDF也不容易上色（可能和PVDF的質(zhì)量有關(guān)，我買(mǎi)的雖然也是MILLIPORE,但好像比較便宜20CM*10CM才50塊錢(qián)）.麗春紅染色也很少能看清條帶，后來(lái)發(fā)現(xiàn)，染色后用甲醇洗，比較容易看出來(lái),但是很難洗掉紅色，不知道有沒(méi)有

15、影響。后來(lái)?yè)Q成NC膜,0.22um，效果挺好的，MARKER易染上，麗春紅也易著色，還一洗就掉。能比較清楚的了解轉(zhuǎn)膜效果。不同轉(zhuǎn)膜儀和電源轉(zhuǎn)膜的條件不同，我用的是BIO-RAD的半干轉(zhuǎn)（電壓不過(guò)25V的那款），電源是BIO-RAD的PC200，70KD的我轉(zhuǎn)50分鐘，20V，17KD的轉(zhuǎn)20V，30分鐘左右，條件不是很穩(wěn)定，有時(shí)半路打開(kāi)蓋子看看MARKER轉(zhuǎn)的情況，但膜和膠的位置一定不能竄。也有人說(shuō)用恒流，說(shuō)1.2-2MA/CM2我看了一下，我的膠大約都是5*3左右大的，20V一般電流會(huì)是60-30MA之間，要是這樣算的話,最高就30MA,我不太清楚.如果用PVDF膜，先用甲醇浸泡一段時(shí)間，我

16、一般是5分鐘，但也有人說(shuō)不過(guò)30秒，不清楚。換了NC膜就直接放入轉(zhuǎn)移緩沖液中的，晃30分鐘左右。濾紙開(kāi)始是買(mǎi)的那種專用濾紙，上面三張，下面三張，后來(lái)有人說(shuō)這種濾紙是做濕轉(zhuǎn)用的，應(yīng)當(dāng)用那種比較厚的，上下各一張，我也不知道，后來(lái)就換成普通濾紙了，上下大約各15張左右，有時(shí)著急還反復(fù)用過(guò)，效果也還可以，估計(jì)問(wèn)題不大。因?yàn)檫@款半干轉(zhuǎn)膜儀說(shuō)明書(shū)上說(shuō)不會(huì)短路，所以一般濾紙膜膠.他們之間一定不要有氣泡.。膜上要做好標(biāo)記，識(shí)別正反面和上下，切個(gè)小角是常用的方法，有MARKER也方便記.轉(zhuǎn)膜后的膠可用考染看看轉(zhuǎn)膜情況.考馬斯亮藍(lán)R250:R2500.25克,甲醇50ML,冰乙酸40ML,加水到100ML.脫色液

17、：乙酸50ML,甲醇225ML（可用乙醇），ddH20500ML10*麗春紅（20ML）:2%麗春紅（0.4克），30%三氯乙酸（6克），30%磺基水楊酸（6克）.用時(shí)加入9倍的ddH2O10*轉(zhuǎn)膜緩沖液:70KD分子量：Tris29克，甘氨酸14.5克，SDS1.85克，加水到500ML.用時(shí)取10ML,加20ML甲醇，加70ML雙蒸水17KD分子量：Tris29克,甘氨酸14.5克,加水到500ML.用時(shí)取10ML,加50ML甲醇，加40ML雙蒸水封閉用5%的封閉液（伊利的高鈣脫脂），室溫，搖床1小時(shí).5%封閉液：1克脫脂奶粉，20ML洗膜液.洗膜液：10*PBS50ML，450MLddH

18、2O，0.5MLTWEEN-20抗體孵育將膜上的封閉液洗去（輕輕晃晃就可）一抗:用雜交液配置濃度可根據(jù)點(diǎn)蛋白實(shí)驗(yàn)，及ECL要求來(lái)定.4度，過(guò)夜.最好有那種4度搖床.我一般早上到實(shí)驗(yàn)室后，再搖床上再搖3個(gè)小時(shí)左右.洗膜液洗3次，每次10分鐘.二抗：用雜交液配置.室溫，搖床，1小時(shí).洗膜液洗3次，每次10分鐘.PBS洗5分鐘.如果一抗沒(méi)有混濁，放置時(shí)間不長(zhǎng)，可以重復(fù)使用，本人一般連作二天時(shí)，才會(huì)重復(fù)用，如果因?yàn)橐豢沟脑蚨怀鼋Y(jié)果，太不值了.雜交液：BSA0.5克，洗膜液50ML.4度保存，如有混濁,重配.點(diǎn)蛋白試驗(yàn)：在正式作WESTERN之前可先做這個(gè),如果沒(méi)有結(jié)果可能提蛋白中不含目的蛋白，也可

19、能一抗與目的蛋白結(jié)合不好,或一,二抗結(jié)合不好（之前拿一滴二抗和ECL試一下是否發(fā)光，以排除二抗的問(wèn)題）.若有結(jié)果，可能選擇一個(gè)比較合適的一，二抗?jié)舛?取小塊膜，放到24孔板中（PVDF先有甲醇泡，烘干）,滴上不同濃度的蛋白（先加5UL,37度烘干，再加5UL,烘干），加封閉液,室溫,搖床一小時(shí)，洗去.加不同濃度一抗,2-3小時(shí)，室溫，搖床.洗膜液洗3次,每次10分鐘不同濃度二抗一小時(shí)，室溫,搖床.洗膜液洗3次，每次10分鐘.PBS洗5分鐘顯色ECL顯影將膜上多余的水吸干，與膠相鄰的一面向上，按ECL說(shuō)明書(shū)配置發(fā)光液點(diǎn)在膜上.不同廠家ECL要求不一樣，本人用的ECL二種液體1:1混合后,0.12

20、5/CM2,放置2分鐘，吸干（可以用微量加樣器抽回來(lái)，可連續(xù)用下一張膜），放在保鮮膜上，包好，壓片.若肉眼可見(jiàn)發(fā)光，可壓10-20秒;若看不到，可壓30分鐘.（再長(zhǎng)的時(shí)間沒(méi)試過(guò)，一般30分鐘不出，就重新再回一次ECL,重做一次，若再不出,就認(rèn)為沒(méi)有了.）轉(zhuǎn)完膜后的膜如果不能及時(shí)做，可放在洗膜液中，4度保存，最多放過(guò)2天，時(shí)間長(zhǎng)了就不知道了.小分子量的蛋白半干轉(zhuǎn)效果比較好，大分子量（100KD）以上建議濕轉(zhuǎn)。具體轉(zhuǎn)膜條件需要多摸一下。30-80KD半干轉(zhuǎn)恒流1mA/cm2,1-1.5h都可以，大分子濕轉(zhuǎn)100V,2.5h以上應(yīng)該可以，轉(zhuǎn)完膜麗春紅染出的條帶比較清楚的話，一般都能有結(jié)果。濕轉(zhuǎn)，Bu

21、ffer一定要預(yù)冷，最好提前一天配好放4度；濾紙不要大過(guò)PVDF膜，防止短路；膠在負(fù)極，膜靠近正極，放入Tank前檢查一遍會(huì)使你免以體會(huì)放反的痛心疾首；膜要標(biāo)記好正反面；轉(zhuǎn)膜過(guò)程中，經(jīng)常過(guò)去看看，防止意外，如電泳儀接觸不好。顯影:轉(zhuǎn)膜后看和你的蛋白分子量近似的預(yù)染Marker有沒(méi)有轉(zhuǎn)過(guò)去，如果marker沒(méi)問(wèn)題，那基本可以認(rèn)為你的蛋白轉(zhuǎn)過(guò)去了。顯色的話應(yīng)該ECL好些吧，靈敏度更高呢，HRP標(biāo)記的二抗孵育完后用TBST充分清洗，然后加ECL試劑，包好后壓片，一般如果你能夠看到熒光的話，壓片5min以內(nèi)就可以看一下，如果看不見(jiàn)的話，直接壓半小時(shí)吧。暗室中壓片，壓片完后顯影、定影、水洗，就可以了。要

22、是對(duì)曝光時(shí)間沒(méi)有把握，可以一次疊兩張膠片，相當(dāng)于做個(gè)梯度。蛋白分子量大小分別為21kd、28kd，用的是濕轉(zhuǎn)，請(qǐng)問(wèn)多大電流，多長(zhǎng)時(shí)間比較合適？解答：分子量比較小，最好是用干轉(zhuǎn)，濕轉(zhuǎn)效率太高，易轉(zhuǎn)過(guò)了。干轉(zhuǎn)的話，用2.5A/cm2，30min就應(yīng)該夠了。濕轉(zhuǎn)，按照bio-rad的說(shuō)明，用100mA，也得要半個(gè)多小時(shí)吧。轉(zhuǎn)膜時(shí)何為濕法，何為半干法？解答：半干法和濕法轉(zhuǎn)移是兩種不同的轉(zhuǎn)移裝置下的轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，將膜，膠，濾紙整個(gè)浸泡在buffer的Tank里轉(zhuǎn)移的，叫濕法；用濾紙吸buffer來(lái)做轉(zhuǎn)移體系的叫半干法半干法轉(zhuǎn)移與膠的面積和蛋白分子兩大小好像都有關(guān)系，那么濕法轉(zhuǎn)移是不是所有的轉(zhuǎn)移條件都一樣呢？

23、一般的條件是怎樣的？解答：半干轉(zhuǎn)的電流大小是按照面積來(lái)算的，時(shí)間是根據(jù)蛋白分子大小定的；而濕轉(zhuǎn)的話電流是恒定的，時(shí)間也是根據(jù)分子量而定。western顯色的方法主要有以下幾種：放射自顯影底物化學(xué)發(fā)光ECL底物熒光ECF底物DAB呈色現(xiàn)常用的有底物化學(xué)發(fā)光ECL和底物DAB呈色，體同水平和實(shí)驗(yàn)條件的是用第一種方法,目前發(fā)表文章通常是用底物化學(xué)發(fā)光ECL。只要買(mǎi)現(xiàn)成的試劑盒就行，操作也比較簡(jiǎn)單，原理如下（二抗用HRP標(biāo)記）：反應(yīng)底物為過(guò)氧化物+魯米諾，如遇到HRP,即發(fā)光，可使膠片曝光，就可洗出條帶。DAB好還是ECL好？答：DAB有毒，但是比較靈敏，是HRP最敏感的底物；ECL結(jié)果容易控制，但被

24、催化時(shí)靈敏度差一點(diǎn)，但如果達(dá)到閥值，就特別靈敏，可以檢測(cè)pg級(jí)抗原。要看你實(shí)驗(yàn)的情況。westernblot的實(shí)驗(yàn)步驟及注意事項(xiàng)的資料把聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白質(zhì)電泳轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上。1）轉(zhuǎn)移緩沖液洗滌凝膠和硝酸纖維素膜，將硝酸纖維素膜鋪在凝膠上，用5ml移液管在凝膠上來(lái)回滾動(dòng)去除所有的氣泡。2）在凝膠/濾膜外再包一張3mm濾紙（預(yù)先用轉(zhuǎn)移緩沖液浸濕），將凝膠夾在中間，保持濕潤(rùn)和沒(méi)有氣泡。3）將此濾紙/凝膠/薄膜濾紙按照廠家建議方法放入電泳裝置中，凝膠面向陰極。4）將上述裝置放入緩沖液槽中，并灌滿轉(zhuǎn)移緩沖液以淹沒(méi)凝膠。5）按照廠家所示接通電源開(kāi)始電泳轉(zhuǎn)移。6）轉(zhuǎn)移結(jié)束后，取出薄膜和凝膠，棄去凝

25、膠。將薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量標(biāo)準(zhǔn)顯現(xiàn)時(shí)取出，記錄下標(biāo)準(zhǔn)位置。用100ml水洗滌纖維素膜，必要時(shí)可用脫色緩沖液。膜置印跡緩沖液中于37C保溫1小時(shí)。室溫下，用PBS-Tween緩沖液洗滌薄膜。用封口機(jī)將薄膜封入塑料袋中，盡可能不留空氣。7袋的一角剪一緩沖液的小口，用透析袋夾緊。8混合：NGS（100微升），印跡緩沖液中的抗體（10毫升），加在裝薄膜的袋中，于室溫下?lián)u動(dòng)2小時(shí)（或4C過(guò)夜）用總體積300mlPBS-Tween緩沖液，分4次在一淺盤(pán)中洗滌薄膜，每次75ml。將連接生物素的羊抗兔IgG（40微升溶于10毫升印跡緩沖液/100微升NGS）加在袋內(nèi)，于室溫下?lián)u動(dòng)1小時(shí)。按步驟

26、9洗滌。加入抗生素蛋白-HRP（40微升溶于10毫升印跡緩沖液/100微升NGS）,于室溫下?lián)u動(dòng)。注意事項(xiàng)：westernblot中轉(zhuǎn)移在膜上的蛋白處于變性狀態(tài)，空間結(jié)構(gòu)改變，因此那些識(shí)別空間表位的抗體不能用于westernblot檢測(cè)。這種情況可以將表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞或細(xì)胞裂解液中的所有蛋白先生物素化，再用酶標(biāo)記親和素進(jìn)行westernblot。實(shí)驗(yàn)中取膠和膜需帶手套。westernblot試驗(yàn)心得前兩天做了一個(gè)westernblot，現(xiàn)在把試驗(yàn)中的一點(diǎn)小小的體會(huì)發(fā)上來(lái)，與大家交流，希望大家多多指點(diǎn)！本實(shí)驗(yàn)室采用的脫脂奶粉已經(jīng)存放了近兩年了，雖然是四攝氏度保存，但是其封閉質(zhì)量還是難以保證的。

27、所以本人的試驗(yàn)結(jié)果中出現(xiàn)了小斑點(diǎn)。建議最好使用BSA或?qū)Ｓ玫拿撝谭圻M(jìn)行封閉，雖然貴點(diǎn)，但還是有個(gè)好點(diǎn)的結(jié)果比較好。本人采用的是過(guò)夜封閉方法，雖然時(shí)間長(zhǎng)，想想封閉效果應(yīng)該是沒(méi)有什么問(wèn)題，但是一定要注意封閉液是否蓋過(guò)了全部的膜，不要漏掉任何一個(gè)小角落喲。洗膜的時(shí)候，最好將膜放在平皿中，置于水平的試驗(yàn)桌面上，不時(shí)用手晃動(dòng)一下平皿，這樣洗膜會(huì)比在脫色搖床上更完全。因?yàn)樵诿撋珦u床上晃動(dòng)，有時(shí)洗滌液不足以完全沒(méi)過(guò)膜，在最后顯色的時(shí)候，會(huì)發(fā)現(xiàn)液體流過(guò)的一道道痕跡，使背景值增加。其實(shí)在westernblot中，以上操作都是小問(wèn)題，最主要的是一抗的質(zhì)量和待檢測(cè)蛋白的提取質(zhì)量。在試驗(yàn)之前，最好先用陽(yáng)性對(duì)照與一抗

28、做免疫學(xué)沉淀檢測(cè)(如ELISA),看看其效價(jià)和質(zhì)量，以便確定在后來(lái)的雜交試驗(yàn)中一抗的選擇和加量。另外，在做雜交之前最好也先跑一塊PAGE膠，染色，檢測(cè)一下待檢蛋白的提取質(zhì)量。在加一抗溫育之前，最好先將等量的一抗與野生型(即陰性對(duì)照)的蛋白在37攝氏度作用30分鐘，這樣可以封閉掉一抗的一些非特異性結(jié)合位點(diǎn)。一定不要忘記做陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，特別是陰性對(duì)照，不然結(jié)果出了什么問(wèn)題，就無(wú)從分析了。全程做下來(lái)，最后的顯色就像是個(gè)一錘定音的時(shí)刻，分外激動(dòng)，但也應(yīng)該尤為專注，一旦目的條帶出現(xiàn)了，就要馬上對(duì)顯色進(jìn)行終止，要不然雜帶就要出來(lái)了。主要試劑1、丙烯酰胺和N，N-亞甲雙丙烯酰胺，應(yīng)以溫?zé)?以利于溶解雙丙稀酰胺)的去離子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N,N-亞甲雙丙烯酰胺儲(chǔ)存液丙稀酰胺29g,N，N-亞甲叉雙丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。)儲(chǔ)于棕色瓶，4C避光保存。嚴(yán)格核實(shí)PH不得超過(guò)7.0，因可以發(fā)生脫氨基反應(yīng)是光催化或堿催化的。使用期不得超過(guò)兩個(gè)月，隔幾個(gè)月須重新配制。如有沉淀，可以過(guò)濾。2、十二烷基硫酸鈉SDS溶液:10%(w/v)0.1gSDS,1mlH2O去離子水配制，室溫保存。3、分離膠緩沖液:1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris和48ml1mol/LHCL混合