PCR 及其相關(guān)技術(shù)在感染性疾病診斷中的應(yīng)用

1、PCR 及其相關(guān)技術(shù)在感染性疾病診斷中的應(yīng)用張洪濤【期刊名稱】包頭醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)【年(卷),期】2014(000)005【總頁(yè)數(shù)】3 頁(yè)(P151-153)【作者】張洪濤【作者單位】鄂爾多斯市中心醫(yī)院康巴什部試驗(yàn)科，內(nèi)蒙古 鄂爾多斯017000【正文語種】中 文聚合酶鏈反映(Polymerase，PCR)是上世紀(jì)八十年代由 等1首次公開發(fā)表的一種NA體外擴(kuò)增技術(shù)。其發(fā)表后激發(fā)起了人們關(guān)于這項(xiàng)技術(shù)的興趣，并且且由此翻開了分子生物學(xué)飛速發(fā)展的新篇章。然而剛開始時(shí)，人們關(guān)于PCR技術(shù)并且不看好。因?yàn)樗粌H操作復(fù)雜，而且成本非常高，并且不能得到普遍應(yīng)用。隨著人們關(guān)于NA聚合酶和實(shí)驗(yàn)條件等因素的不斷優(yōu)化和改

2、進(jìn)，使得PCR逐漸發(fā)展成為成本較低、操作簡(jiǎn)便為人們所接受的常用實(shí)驗(yàn)技術(shù)。PCR的基本原理類似于體內(nèi)NA復(fù)制的進(jìn)程，經(jīng)過模板NA的變性，由雙鏈變?yōu)閱捂準(zhǔn)怪c引物接合退火，然后在NA聚合酶的作用下4種堿基相互連接即延伸，形成與模板相同的NA，反復(fù)此步驟即可使目的基因進(jìn)行數(shù)百萬倍的放大。從原理可看出， PCR能將幾個(gè)拷貝目的基因進(jìn)行放大，并且在短時(shí)間內(nèi)得到擴(kuò)增，具有特異性高、靈敏度高、簡(jiǎn)便快捷易自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)。在這二十多年的時(shí)間里，PCR得到了不斷相關(guān)方法。PCR 及其相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，優(yōu)化了實(shí)驗(yàn)條件并且且自動(dòng)化程度也越來越高，開辟了臨床診斷感染性疾病的新路徑。PCR 在細(xì)菌感染性疾病診斷中的應(yīng)用診斷和

3、治療的要求。因此，開發(fā)新的實(shí)驗(yàn)診斷方法顯得非常必要。PCR 廣泛應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 16SrRNA 基因的定量檢測(cè)，可以關(guān)于病原3 h 的時(shí)間內(nèi)得出結(jié)果，且不受抗菌藥物的干擾。王榮山等216sRNA 基因的保守區(qū)引物和TaqMan 195 例疑為敗血癥和化腦患兒的標(biāo)本， 經(jīng)過和常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)的結(jié)果比較，熒光定量PCR 的陽(yáng)性率高于血培養(yǎng)的陽(yáng)性率， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。吳亦棟等3830 例敗血癥的新生兒標(biāo)本， 得出相同的結(jié)論，并且且經(jīng)過檢測(cè)非感染性疾病患兒的血標(biāo)本表明實(shí)時(shí)熒光PCR 方法的高敏感性和特異性。王小光等4PCR結(jié)果， 得出PCRPCR法僅是傳統(tǒng)25 %左右。PCR具有簡(jiǎn)便快速等優(yōu)點(diǎn)，

4、然而它不能夠進(jìn)行活菌定量， 而且操作不當(dāng)容易產(chǎn)生假陽(yáng)性，但是這不能夠掩蓋它的優(yōu)勢(shì)。在加強(qiáng)感染性疾病病原體的研究中，成軍5認(rèn)為以 PCR 為基礎(chǔ)的分子診斷技術(shù)是感染性疾病診斷、治療的重要方法。PCR 不僅能夠鑒定細(xì)菌，而且能夠針關(guān)于細(xì)菌的某一特定的基因進(jìn)行檢測(cè)?；魜y弧菌的ctxA 基因是霍亂弧菌的致病基因，且具有特異性。經(jīng)過PCR 不僅可以確認(rèn)霍亂弧菌的感染，而且可以判斷其是否為產(chǎn)毒株，進(jìn)而探討其流行特性并且進(jìn)行流行預(yù)測(cè)6O157 ：H7 血274 歲以下兒童急性腎衰竭的主要病原菌7O157 ：H7 近年來引發(fā)的食物中毒事件時(shí)離和鑒定O157 ：H7 并且關(guān)于其致病因素做出快速診斷，朱姝媛等8P

5、CR 法，擴(kuò)增出了致病相關(guān)基因，并且且進(jìn)行了證實(shí)，建立了快速檢測(cè)O157 ：H7 及其毒力的方法。除大腸桿菌外，關(guān)于其它細(xì)菌進(jìn)行快速診斷的PCR 方法也有非常多的報(bào)道。如朱兵清等9TaqMan 熒光探針建立了流感嗜血桿菌和肺炎鏈球菌檢測(cè)的方法。幽門螺旋桿菌(Hp感染常會(huì)導(dǎo)致胃炎、胃潰瘍等疾病，如不進(jìn)行治療常會(huì)終身帶菌。Hp 13C 呼氣試驗(yàn)，然而前者常為侵襲性檢查，隨后者需要特殊儀器，限制其應(yīng)用。等1028 例長(zhǎng)期胃不舒服兒童的糞便標(biāo)本，并且應(yīng)用PCR Hp 基因，得到了陽(yáng)性結(jié)果，因此認(rèn)為PCR Hp 的感染。結(jié)核病是一個(gè)全球要多次送檢。針關(guān)于這一難題黃平等11將確診為結(jié)核病患者的標(biāo)本進(jìn)行熒光

6、PCR 值。PCR 在病毒感染性疾病診斷中的應(yīng)用近些年由于人類的行為關(guān)于環(huán)境和生態(tài)的影響，造成了一些未知的病原體引發(fā)的新的感染性疾病，例如嚴(yán)重急性呼吸綜合征(server acute respiratirysynrome,SARS)性疾病中的應(yīng)用。隨著分子生物學(xué)相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，PCR成為臨床診斷病毒感染的常用方法。2003 年流感與暴發(fā)，關(guān)于人民的生命安全造成非常大的影響， 據(jù)了解3040。按國(guó)家要求，流行性感冒的診斷依靠病程小雯等12利用熒光定量RT-PCR 患者的咽拭子標(biāo)本，表明了此種方法簡(jiǎn)便，靈敏度、特異度都較高，可作為一種快速診斷 病毒的方法。2009 年發(fā)生的甲型H1N1 200 多

7、個(gè)國(guó)家，全癥狀不典范，較難確診。Poon 等13PCR 方法關(guān)于H1N1 進(jìn)行了鑒甲流進(jìn)行了許多相關(guān)的分子生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)。張欣等14通PCR 和抗原方法同時(shí)比170 PCR 方法特異度和敏感度均較高，契合臨床需要。而且經(jīng)過和傳統(tǒng)的膠體金等方法的比較，越發(fā)肯定了PCR 方法的優(yōu)越性15-16。除了關(guān)于甲型H1N1 病毒的檢測(cè)，PCR 在關(guān)于不明原因的肺炎和流感樣感病毒和呼吸道合胞病毒17。因此，PCR 技術(shù)不僅能快速診斷感染病原體，而且能為感染監(jiān)測(cè)和疾病的流行趨勢(shì)進(jìn)行預(yù)測(cè)。乙肝病毒攜帶者在我國(guó)是一個(gè)數(shù)量龐大的群體，乙肝血清標(biāo)志物的檢測(cè)是以往傳統(tǒng)檢測(cè)乙肝病的的主要方法。PCR 在檢測(cè)病原體時(shí)快速、高

8、效，并且且能夠了解病毒攜帶者體內(nèi)的病毒載量，關(guān)于其是否需要抗病毒治療做出指導(dǎo)。除此之外PCR 還能夠跟蹤疾病的預(yù)后，關(guān)于臨床用藥有非常重要的指導(dǎo)意義18 。PCR 在檢測(cè)真菌性感染疾病中的應(yīng)用近些年隨著抗生素的普遍應(yīng)用、免疫克制劑的使用、器官移植和侵入性治療等，使得真菌感染變得也越來越普遍，形勢(shì)也很嚴(yán)峻。為了改善疾病的預(yù)后和治療效果， 早期診斷疾病顯得非常急迫。因此，靈敏快速的PCR 也被用到了真菌檢測(cè)中。徐云飛等195.8SrNA 作為檢測(cè)靶基因，設(shè)計(jì)其引物和TaqMan PCR 優(yōu)于傳統(tǒng)方法。曹國(guó)君等20用相同的方法表明了此結(jié)論。顏丹等21用PCR 檢測(cè)200 多份足癬患者的皮屑，其陽(yáng)性率

9、和敏感性都得到了確證。Khot 等22用定量PCR 檢測(cè)支氣管肺泡灌洗液，關(guān)于診斷曲霉性肺炎有很好的效果。然而PCR 無法辨別法來達(dá)到早期診斷疾病的目的。PCR 在國(guó)內(nèi)的應(yīng)用已經(jīng)非常廣泛，并且且得到了臨床大夫的好評(píng)。然而PCR 方法也有不足，最令人頭疼的問題就是易污染，極其微量的污染都可能造成假陽(yáng)性。實(shí)驗(yàn)室中造成假陽(yáng)性的原因有標(biāo)本之間的污染、試劑污染等，最嚴(yán)重的是擴(kuò)增產(chǎn)物的污PCR 實(shí)驗(yàn)室要做到以下幾點(diǎn)：設(shè)立嚴(yán)格的陰陽(yáng)性關(guān)于照； 操作嚴(yán)格分區(qū)，各區(qū)耗材試劑不可混用；操作者嚴(yán)格操作規(guī)矩等。PCR 技術(shù)的發(fā)展是分子生物學(xué)上的里程碑，同時(shí)也極大推動(dòng)了疾病診斷方法的改進(jìn)。然而PCR方法還不能夠取代傳統(tǒng)

10、的細(xì)菌培養(yǎng)，細(xì)菌培養(yǎng)仍然是病原體鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)。但是PCR 的優(yōu)越性不能否認(rèn)，應(yīng)該采用兩種方法綜合分析從而關(guān)于病原體的診斷做出正確的結(jié)論。參考文獻(xiàn)KB,ofNAa reactionJ.Methos Enzymol,1987,155:335- 350.王榮山,吳亦棟尚世強(qiáng)等.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)菌方法的建立及其臨床應(yīng)用J.中華圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)雜志,2005,8(4):242-245.吳亦棟,尚世強(qiáng)李建平等.16sRNAPCR診斷新生兒敗血癥中華兒科雜志,2007,45(6):446-449.王小光,汪萍劉繼倩等.PCR 在大樣本低概率細(xì)菌試驗(yàn)項(xiàng)目中的應(yīng)用研究C.第十六屆全國(guó)衛(wèi)生試驗(yàn)新技術(shù)學(xué)術(shù)研究會(huì)暨展

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