實(shí)驗(yàn)六小鼠精巢細(xì)胞減數(shù)分裂標(biāo)本的制備

關(guān)于實(shí)驗(yàn)六小鼠精巢細(xì)胞減數(shù)分裂標(biāo)本的制備第一頁(yè)，共二十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一【背景知識(shí)】

減數(shù)分裂（Meiosis）是發(fā)生于生殖細(xì)胞的一種特殊的細(xì)胞分裂方式，DNA復(fù)制一次，而細(xì)胞連續(xù)分裂兩次，形成單倍體的精子和卵子。減數(shù)分裂遠(yuǎn)比有絲分裂復(fù)雜，經(jīng)兩次細(xì)胞分裂，分別稱減數(shù)分裂Ⅰ、減數(shù)分裂Ⅱ，兩次分裂間又一個(gè)較短的間期，這個(gè)間期DNA不復(fù)制。

第二頁(yè)，共二十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一示意圖第三頁(yè)，共二十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一一、減數(shù)分裂I

1、前期I

減數(shù)分裂的特殊過(guò)程主要發(fā)生在前期I，通常人為劃分為5個(gè)時(shí)期：①細(xì)線期（leptotene）、②偶線期（zygotene）、③粗線期（pachytene）、④雙線期（diplotene）、⑤終變期（diakinesis）。

終變期：二價(jià)體顯著變短，并向核周邊移動(dòng)，在核內(nèi)均勻散開(kāi)。2、中期I3、后期I4、末期I第四頁(yè)，共二十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一二、減數(shù)分裂II可分為前、中、后、末四個(gè)四期，與有絲分裂相似。

第五頁(yè)，共二十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一

實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)滴片法制備單細(xì)胞懸液染色體的一般方法。以小鼠精巢細(xì)胞染色體制片為標(biāo)本觀察減數(shù)分裂過(guò)程中不同時(shí)期的染色體。第六頁(yè)，共二十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一

【試驗(yàn)原理】雄性動(dòng)物精子發(fā)生于睪丸曲精細(xì)管的生精上皮細(xì)胞，由其中的精原細(xì)胞經(jīng)多次有絲分裂和生長(zhǎng)，形成初級(jí)精母細(xì)胞，初級(jí)精母細(xì)胞經(jīng)減數(shù)分裂形成次級(jí)精母細(xì)胞，次級(jí)精母細(xì)胞有絲分裂成精細(xì)胞，再經(jīng)一系列變化成精子。因此，通過(guò)分離曲細(xì)精管、剪碎并加入液體吹打，可使官腔各種細(xì)胞游離出來(lái)，然后經(jīng)過(guò)低滲、固定、染色等過(guò)程就可制成包含減數(shù)分裂各期的標(biāo)本。第七頁(yè)，共二十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一小鼠曲細(xì)精管管腔第八頁(yè)，共二十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一曲細(xì)精管管腔

第九頁(yè)，共二十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一【實(shí)驗(yàn)材料及用品】

1、

材料：成年雄性小白鼠2、

用品：注射器、平皿、尖頭鑷子、剪刀（普通剪刀、眼科小剪刀）、吸管、離心管、離心機(jī)、玻片等。第十頁(yè)，共二十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一實(shí)驗(yàn)試劑1、100g/ml秋水仙素。2

、

2％檸檬酸鈉溶液3、

0.075M的KCI4、31甲醇冰醋酸及11甲醇冰醋酸（應(yīng)現(xiàn)配）5、PH6.8，0.01M的PBS緩沖液6、Gimesa原液7、Gimesa工作液：1份Gimesa原液加9份PH6.8，0.01M的PBS緩沖液，混勻。工作液應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)稀釋。

第十一頁(yè)，共二十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一

【實(shí)驗(yàn)操作】1、注射秋水仙素，增加中期分裂相。試驗(yàn)前4－5小時(shí)，小鼠腹腔注射秋水仙素0.5ml（100g/ml）。2、取睪丸并清洗。斷頸處死小鼠，剖開(kāi)腹部，取出腎形睪丸，放入盛有4－5ml2％檸檬酸鈉溶液的平皿中清洗并去掉外面脂肪等物，棄污液。

3、挑出曲細(xì)精管并剪碎。另加檸檬酸鈉溶液1ml，用尖頭鑷尖或解剖針將曲細(xì)精管拉出，并用眼科剪盡量將其剪碎。第十二頁(yè)，共二十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一【實(shí)驗(yàn)操作】4、游離并收集細(xì)胞。將剪碎的曲細(xì)精管及溶液移入離心管中，用吸管反復(fù)吸打1－2min，使盡量多的細(xì)胞從管腔中游離出來(lái)；靜置5min（或300rpm離心2min），使大的膜管狀雜質(zhì)下沉；吸上清液于另一管中，1000rpm離心5min，沉淀即為不同發(fā)育階段的細(xì)胞。

5、低滲處理，使細(xì)胞脹大。加入5ml0.075M的KCI，輕輕（為什么？）吹打混勻，靜置10min。第十三頁(yè)，共二十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一【實(shí)驗(yàn)操作】

6、預(yù)固定。向離心管中加入1ml31甲醇冰醋酸，輕輕吹打混勻，靜置2min，1000rpm離心8min，棄上清。

7、固定。向上述沉淀中加入5ml31甲醇冰醋酸，吹打混勻，靜置10－20min，1000rpm離心8min，棄上清。

8、再固定。加5ml11甲醇冰醋酸，吹打混勻，靜置5min，1000rpm離心8min，棄上清，加3－4滴11甲醇冰醋酸固定液懸浮細(xì)胞。

第十四頁(yè)，共二十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一【實(shí)驗(yàn)操作】9、滴片。滴一滴細(xì)胞懸液于冰水中剛撈出的濕載玻片上，自然干燥。10、染色。

Gimesa染液染20-30min，流水洗去多余染液，待干

第十五頁(yè)，共二十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一【注意事項(xiàng)】1、收集盡量多的細(xì)胞

2、加入低滲液后一定要輕輕吹打，以免細(xì)胞核提前破裂，引起染色體外遺、無(wú)規(guī)則排列。

3、滴片時(shí)玻片一定要帶水4、注意染色。

第十六頁(yè)，共二十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一【結(jié)果觀察】

觀察各期細(xì)胞核及染色體。第十七頁(yè)，共二十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一作業(yè)：繪制所看到的中期Ⅰ和中期Ⅱ的染色體圖，說(shuō)明其中染色單體組成情況。

第十八頁(yè)，共二十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一骨髓細(xì)胞的收集1、來(lái)源豐富、個(gè)體較小的小動(dòng)物骨髓細(xì)胞收集法：（1）處死動(dòng)物，取長(zhǎng)骨（2）去干凈骨上所附肉（先用刀片刮，再用紗布擦）（3）用剪刀剪開(kāi)骨頭兩端（4）用注射器吸生理鹽水或低滲液將骨髓