常春藤皂甙元抗肝癌作用研究

常春藤皂甙元抗肝癌作用研究肝細(xì)胞癌(HepatocellμlarCarcinoma,HCC)(簡稱肝癌)的發(fā)病率在所有惡性腫瘤中排在第二位,僅次于肺癌,其發(fā)病率因地區(qū)不同而有所差異,發(fā)達(dá)國家明顯低于發(fā)展中國家,亞洲國家的發(fā)病率高于美國和西歐國家,在我國其發(fā)病率已超過25/10萬,其中高發(fā)區(qū)之肝癌標(biāo)準(zhǔn)化發(fā)病率達(dá)49.17/10萬人口。據(jù)統(tǒng)計(jì),我國每年新增近30余萬肝癌患者,占全世界每年新增肝癌患者的一半。另外,我國每年死于肝癌的病人約為30萬人,患者5年生存率僅為2.7%。肝癌患病一般不易察覺、且發(fā)展迅速,患者的生存期短、后期生存質(zhì)量較差。早期肝癌的治療以手術(shù)治療為首選并輔以放射療法和或化學(xué)療法;中晚期肝癌及轉(zhuǎn)移性肝癌以放射療法和或化學(xué)療法為主,一般不建議手術(shù)。近年來,隨著中藥抗腫瘤研究的興起,天然植物藥在癌癥治療中受到了廣泛的關(guān)注。在前期研究工作中,筆者曾對(duì)八月札水提物的抗肝癌作用進(jìn)行了初步的研究,發(fā)現(xiàn)其能夠明顯降低H22荷瘤小鼠體內(nèi)腫瘤的重量,對(duì)肝癌細(xì)胞的生長和增殖具有顯著的抑制作用。同時(shí),八月札水提物還能夠顯著提高H22荷瘤小鼠的免疫水平,提高機(jī)體抗氧化應(yīng)激、清除自由基和維持內(nèi)環(huán)境活性氧動(dòng)態(tài)平衡的能力。由此推測,八月札水提物可能通過誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡和上調(diào)機(jī)體免疫水平而發(fā)揮抗腫瘤作用。本研究將八月札的主效成份常春藤皂甙元(Hederagenin,HD)作為研究對(duì)象,并通過H22荷瘤小鼠體內(nèi)試驗(yàn)和HepG2細(xì)胞體外培養(yǎng)試驗(yàn),應(yīng)用MTT、RT-PCR、免疫熒光、WesternBlot、AO/EB凋亡染色、Hoechst33342凋亡染色、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、NK細(xì)胞活性檢測以及流式細(xì)胞術(shù)等方法,試圖探討HD抗肝癌作用及在腫瘤細(xì)胞調(diào)控、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和免疫調(diào)節(jié)等方面的作用及相關(guān)機(jī)制,并獲得如下結(jié)果。1.在HD對(duì)H22荷瘤小鼠抗肝癌作用的研究中,首先建立H22荷瘤小鼠模型,隨機(jī)分為5組,每組12只,即對(duì)照組、環(huán)磷酰胺(CTX)陽性對(duì)照組、HD低劑量組(100mg/Kg)、HD中劑量組(200mg/Kg)和HD高劑量組(400mg/Kg)。經(jīng)不同劑量的HD連續(xù)干預(yù)H22荷瘤小鼠14d后,可觀察到H22荷瘤鼠腫瘤組織的生長和增殖受到明顯的抑制,小鼠的生存狀態(tài)和生命體征與對(duì)照組比較得到明顯的改善。HD各試驗(yàn)組(100mg/Kg、200mg/Kg和400mg/Kg)均能顯著地抑制H22荷瘤小鼠腫瘤的生長(P<0.01),腫瘤抑制率分別為29.67%、42.75%和40.26%。通過HE染色觀察H22荷瘤小鼠肝臟和腎臟的組織結(jié)構(gòu),以及對(duì)肝和腎功能相關(guān)指標(biāo)的檢測,發(fā)現(xiàn)HD對(duì)小鼠無明顯的毒副作用。通過免疫熒光法檢測各試驗(yàn)組H22荷瘤小鼠腫瘤組織中突變型P53、P21和Bcl-2蛋白的表達(dá)情況,研究結(jié)果顯示,對(duì)照組小鼠的腫瘤組織中突變型P53和Bcl-2蛋白呈高表達(dá),而P21蛋白則相反呈現(xiàn)低表達(dá)。經(jīng)HD和CTX處理后的小鼠腫瘤組織中突變型P53和Bcl-2蛋白的表達(dá)顯著降低(P<0.01),而P21蛋白的表達(dá)則顯著升高(P<0.01)。以上結(jié)果揭示HD可能通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡而發(fā)揮抗腫瘤作用。2.在HD誘導(dǎo)H22荷瘤小鼠腫瘤細(xì)胞凋亡作用研究中,應(yīng)用免疫熒光、RT-PCR和Westernblot等技術(shù),對(duì)腫瘤組織中Bcl-2、Bax、Fas、Fasl、Caspase-3和Caspase-8基因在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的表達(dá)進(jìn)行了研究。與對(duì)照組比較,HD各試驗(yàn)組H22荷瘤小鼠腫瘤組織細(xì)胞中Bcl-2在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的表達(dá)均顯著降低(P<0.01),而Bax、Fas、FasL、Caspase-3、Caspase-8在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的表達(dá)均顯著升高(P<0.01)。以上結(jié)果揭示HD可能通過激活細(xì)胞凋亡的線粒體途徑和死亡受體途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,從而發(fā)揮其抗腫瘤作用。3.在HD對(duì)H22荷瘤小鼠免疫功能的影響研究中,通過分析HD治療前后小鼠免疫器官組織結(jié)構(gòu)和功能的變化,發(fā)現(xiàn)HD各試驗(yàn)組均可以明顯的改善H22荷瘤小鼠的胸腺指數(shù)和脾指數(shù)(P<0.05),初步判定HD能夠促進(jìn)H22荷瘤小鼠胸腺和脾臟兩大免疫器官的修復(fù)。同時(shí),HD能夠顯著提高H22荷瘤小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖能力(P<0.01),顯著提高小鼠免疫器官中的NK細(xì)胞的殺傷能力(P<0.05);HD能夠顯著增加CD4+T淋巴細(xì)胞的數(shù)量,提升CD4+/CD8+的比值(P<0.05),表明HD能通過調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞亞群的數(shù)目和比例進(jìn)而改善細(xì)胞免疫應(yīng)答。另外,HD還能夠調(diào)節(jié)H22荷瘤小鼠外周血中IL-2和TNF-α的表達(dá)水平,尤其HD200mg/Kg和400mg/Kg組作用顯著(P<0.05)。以上結(jié)果揭示HD可能通過修復(fù)免疫器官、調(diào)控細(xì)胞免疫應(yīng)答和改善細(xì)胞因子水平而發(fā)揮抗腫瘤作用。4.在HD體外抑制HepG2細(xì)胞作用的研究中,經(jīng)不同濃度的HD(濃度為0、30、60、90、120和180μg/mL)干預(yù)HepG2細(xì)胞24h和48h后,HD對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用不斷增強(qiáng),并呈劑量時(shí)間依賴關(guān)系。HD各試驗(yàn)組對(duì)HepG2細(xì)胞的生長和增殖均表現(xiàn)出顯著的抑制作用,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);24h的抑制率分別為5.26%、8.73%、11.00%、16.44%和27.72%;48h的抑制率分別為1.80%、11.01%、19.38%、27.76%和42.01%。經(jīng)HE染色和激光共聚焦檢測,HD干預(yù)48h后,HepG2細(xì)胞呈煎蛋樣改變,出現(xiàn)膜小泡和凋亡小體,核染色質(zhì)分布不均勻,并且核膜破損,呈典型的細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)改變。另外,通過AnnexinV–FITC雙染觀察,經(jīng)HD處理48h后,HepG2細(xì)胞出現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象,進(jìn)一步證明了HD能夠誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生凋亡。當(dāng)濃度為120和180μg/mL時(shí),HD誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞的發(fā)生凋亡的百分比分別為12.10%和17.90%,顯著高于對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。以上結(jié)果揭示HD可能是通過誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡而發(fā)揮其抗肝癌作用。5.在HD體外誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究中,應(yīng)用免疫熒光和Westernblot技術(shù),對(duì)HepG2細(xì)胞中突變型P53、Bcl-2、Bax、Fas、Fasl、Caspase-3和Caspase-8的表達(dá)變化情況進(jìn)行研究。與對(duì)照組比較,經(jīng)HD處理的HepG2細(xì)胞中突變型P53和Bcl-2蛋白的表達(dá)水平明顯降低(P<0.01),而Bax、Fas、Fasl、Caspase-3和Caspase-8蛋白的表達(dá)顯著升高(P<0.01),進(jìn)一步表明HD誘導(dǎo)HepG2凋亡作用可能與其激活細(xì)胞凋亡的線粒體途徑和死亡受體途徑密切相關(guān)。本研究通過動(dòng)物模型體內(nèi)試驗(yàn)和細(xì)胞培養(yǎng)體外試驗(yàn)兩個(gè)途徑,探討了HD對(duì)H22荷瘤小鼠和HepG2細(xì)胞的抗腫瘤作用及相關(guān)機(jī)制,通過藥理學(xué)、病理學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)等相關(guān)技術(shù)和方法