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1、第三章基因工程約束,概述1,基本概念DNA重組技術(shù):基因克隆或分子克隆技術(shù)。的研究?;蚬こ?gene engineering): 2,基因工程生產(chǎn)的基礎(chǔ)1理論上3大發(fā)現(xiàn)40年代闡明了生物遺傳物質(zhì)-DNA 50年代生物遺傳物質(zhì)的分子機(jī)制,Watson and Crick提出了DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型。20世紀(jì)60年代,遺傳信息傳遞方式-中心法則,2技術(shù)上發(fā)明了限制性內(nèi)切酶和連接酶發(fā)現(xiàn)傳遞體(Vector)的發(fā)現(xiàn):傳遞體將重組DNA分子轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)錄酶發(fā)現(xiàn),中心法則突破,使真核基因的制備成為可能。1、重組DNA技術(shù)的基本過(guò)程基因工程元素目的基因的制備和分離DNA重組體的構(gòu)建DNA重組體擴(kuò)增和

2、表達(dá)重組體篩選及外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離純化和鑒定;2、基因工程分類真核基因工程原核基因工程;3、重組DNA技術(shù)基因工程和醫(yī)學(xué)的關(guān)系1?;虻慕Y(jié)構(gòu)功能及活動(dòng)規(guī)律研究。2.為疾病的防治、診斷、預(yù)后及發(fā)病機(jī)理的研究開(kāi)辟了新的道路。研究細(xì)胞分化和胚胎發(fā)育的本質(zhì)問(wèn)題。4.基因治療。5.促進(jìn)基礎(chǔ)理論的研究。第四,用基因工程技術(shù)準(zhǔn)備藥物的優(yōu)點(diǎn)是珍貴的,但傳統(tǒng)方法難以準(zhǔn)備的藥物可以提供充足的生理活性物質(zhì),對(duì)生理、生化、結(jié)構(gòu)進(jìn)行深入研究??梢园l(fā)現(xiàn)發(fā)掘更多的內(nèi)源性生理活性物質(zhì)。內(nèi)源性生理活性物質(zhì)用作藥物時(shí)存在的缺點(diǎn)可以通過(guò)基因工程及蛋白質(zhì)工程進(jìn)行改造和克服。利用基因工程技術(shù),可以獲得新型化合物,擴(kuò)大藥物選擇源。第

3、三節(jié)基因工程酶和載體第一部分:工具酶限制內(nèi)切酶和甲基化酶DNA連接酶DNA多聚酶第二部分:基因工程載體原核細(xì)胞(大腸桿菌)的一般載體:真核細(xì)胞載體:第一部分:工具酶限制內(nèi)切酶和甲基化酶限制內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)限制內(nèi)切酶的生理功能限制內(nèi)切酶的分類和命名識(shí)別和切割部位及2限制性內(nèi)切酶的生理功能構(gòu)成了細(xì)胞抵抗外源入侵DNA的防御機(jī)制,提供了細(xì)菌種間交叉繁殖的障礙,但外源DNA允許有一些遺漏。3限制性內(nèi)切酶的分類和命名的三種茄子類型:類型、類型、類型命名:ECORE3360 Escherichia中的Co:coli種R: RY13注:牙齒菌株第一個(gè)發(fā)現(xiàn)核酸內(nèi)切酶,4型限制性核酸內(nèi)切酶:與DNA鏈切割相同),標(biāo)

4、識(shí)序列:剪切結(jié)束:5GTT AAG-3,3CAA TTG-5,5GTT 3gacgtc-5,5ctgca-3,3-g,c c g g g g g g c c c c,c c c g g g g g c c c c,b :isocaudarner,6反應(yīng)系統(tǒng)配置:酶和活性緩沖,2,DNA連接酶功能:常用于促進(jìn)酶形成磷酸二酯鍵的連接酶:T4 DNA連接酶大腸桿菌DNA連接酶,來(lái)自1 T4 DNA ligase T4感染的Ecoli,MR:68Kd,輔助系數(shù)0.4毫米ATP)基板10pM連接酶:0.01-0.1unit 3)反應(yīng)溫度和時(shí)間:16,夜間4)用途:粘著DNA或切口間連接作用:封閉雙螺旋D

5、NA具有5磷酸乙酰和3羥基槽口(nick),形成磷酸酯鍵無(wú)法封閉裂縫。因此粘性末端的DNA片段可以連接,而扁平末端的DNA片段不能連接。用途:點(diǎn)端DNA and RNA之間的連接,3 DNA聚合酶Taq DNA聚合酶逆轉(zhuǎn)錄酶(reverse transcriptase)端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(Terminal Deoxynucleotidayl Transferase),(不會(huì)從引物樣板分離。1大腸桿菌DNA聚合酶(E.coli聚合酶)來(lái)自E.coli細(xì)胞。Mr:109kD。由單個(gè)多肽組成。沿DNTP模板催化核苷酸聚合是多用途酶,有三種茄子活性:5-3外體酶,N,3-5外體酶,聚合酶,C,5 cg

6、catcg gcgtatc,5 cattag 3 gcgtagc,PC,PG,3)單鏈特異性3-5外體酶沒(méi)有活性dNTP時(shí),在3-OH端分解ss-DNA或玻璃3_OHMW:7.6KDa。具有聚合酶I的53聚合酶活性以模板和引物存在時(shí)的dNTP為底物,合成5-3方向與模板互補(bǔ)的DNA。對(duì)于單鏈DNA,有3 5外體酶活性,弱,不適合3突出端的平滑無(wú)53外體酶活性。Klenow片段用途:填充3延伸端平端,通過(guò)限制酶消化消化dsDNA。用32PdNTP作反平反反應(yīng),可以在DNA 3末端標(biāo)記cDNA的第二鏈。在寡核苷酸定向突變中,雙鏈DNA合成在Sanger ddNTP系統(tǒng)中進(jìn)行順序分析。(b) Taq

7、 DNA聚合酶Taq DNA聚合酶是依賴耐熱DNA的DNA聚合酶。MW:6.5kDa .在模板和引物存在條件下,模板和互補(bǔ)的脫氧核苷酸一次選擇性連接到引物3OH末端的反應(yīng)端A,即粘性端53外核酸酶活性具有鏈?zhǔn)教鎿Q能力。35沒(méi)有外切核酸酶激活,沒(méi)有校準(zhǔn)功能,便于突變。Mg2依賴性酶,用途:DNA序列分析;應(yīng)用于聚合酶連接反應(yīng)(PCR),在體外擴(kuò)增DNA分子的特定序列(產(chǎn)物是粘著的)。pfu DNA聚合酶具有DNA聚合酶活性,反轉(zhuǎn)錄活性不具有3-5方向的外體酶活性。產(chǎn)物是平端,但牙齒聚合酶的產(chǎn)量低于Taq DNA聚合酶。一般來(lái)說(shuō),PCR反應(yīng)高保真,(3),逆轉(zhuǎn)錄酶(reverse transcri

8、ptase) 1特征:依賴mRNA的ccDNA聚合酶單鏈DNA或RNA作為模板使用時(shí),使用逆轉(zhuǎn)錄酶準(zhǔn)備混合探針。標(biāo)記有5個(gè)突起的DNA片段。用于雙脫氧鏈測(cè)序反轉(zhuǎn)錄PCR。(4)末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(Terminal deoxynucleotidayl Transferase)簡(jiǎn)稱終端轉(zhuǎn)移酶(Terminal Transferase)在犢牛胸腺、Mr:34kD、堿性蛋白中作用:當(dāng)二價(jià)正離子存在時(shí),dNTP在5-3方向聚合,依次加到線性DNA分子的3OH端。不需要模板,4茄子dNTP中的任何一個(gè)都可以用作燈泡。只有一個(gè)dNTP是由一個(gè)核苷酸三尾、直立人的尾巴組成的,用途:在載體或cDNA上加上同系

9、物。(阿爾伯特愛(ài)因斯坦,Northern Exposure(美國(guó)電視電視劇),3末標(biāo)有32P的dNTP標(biāo)記。使用鄭智薰放射性標(biāo)記生物素-11-dUTP滲透到DNA片段分子的3端。第2部分:基因工程載體1,概述載體的概念(Vector):所有來(lái)自質(zhì)?;蚴删wDNA分子的DNA分子都可以插入或克隆目標(biāo)基因,并傳遞外源DNA的宿主細(xì)胞功能的DNA片段稱為載體。有效地將外原油電子的功能和特征,外原油電子轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞,為外原油電子提供復(fù)制能力或整合能力,為外原油電子的擴(kuò)增或表達(dá)提供必要的條件,為載體需要具備的條件,對(duì)受體細(xì)胞具有親合性或親合性(轉(zhuǎn)移性)的過(guò)濾標(biāo)記,具有高外源DNA的裝載能力,多種單一核

10、酸內(nèi)切酶識(shí)別切斷點(diǎn)適合特定受體細(xì)胞的復(fù)制點(diǎn)或整合點(diǎn),基因工程載體,和質(zhì)粒常見(jiàn)的原核細(xì)菌和真菌中絕大多數(shù)的質(zhì)粒是DNA型的絕大多數(shù)天然DNA質(zhì)粒是共價(jià)、閉合、環(huán)的分子結(jié)構(gòu),即CCDNA(Closed and circular double-stranded DNA)質(zhì)粒DNA的分子量范圍: 利用質(zhì)粒宿主細(xì)胞的DNA復(fù)制系統(tǒng),可以自主復(fù)制的質(zhì)粒DNA的復(fù)制子結(jié)構(gòu),根據(jù)每個(gè)細(xì)胞的分子數(shù)量(副本數(shù)量),決定質(zhì)粒對(duì)宿主的對(duì)應(yīng)關(guān)系。 質(zhì)粒兩種茄子主要復(fù)制類型:嚴(yán)格復(fù)制控制的質(zhì)粒1-3復(fù)制松弛型復(fù)制控制的質(zhì)粒10-60復(fù)制質(zhì)粒不兼容,包含相似復(fù)制者結(jié)構(gòu)的兩個(gè)不同質(zhì)粒,不能同時(shí)存在于一個(gè)細(xì)胞中。這稱為質(zhì)粒不兼

11、容,不兼容的質(zhì)粒配置不兼容群。大腸桿菌質(zhì)粒:ColE1,pMB1具有相似的復(fù)制因子結(jié)構(gòu),徐璐不兼容的pSC101,F(xiàn),RP4具有相似的復(fù)制因子結(jié)構(gòu),徐璐不兼容的p15A和衍生質(zhì)粒具有相似的復(fù)制因子結(jié)構(gòu),徐璐不兼容,質(zhì)粒不兼容:分子機(jī)制,包含類似的復(fù)制因子。因此,經(jīng)過(guò)多個(gè)復(fù)制周期和細(xì)胞分裂周期后,它們?nèi)钥梢栽谕患?xì)胞中共存。其中具有大量復(fù)制的質(zhì)粒在未來(lái)的細(xì)胞分裂周期中更有優(yōu)勢(shì)。在復(fù)制時(shí),每個(gè)質(zhì)粒都由其自己的復(fù)制數(shù)控制系統(tǒng)協(xié)調(diào),從而可以創(chuàng)建一定數(shù)量的最終副本??梢苑譃橘|(zhì)粒轉(zhuǎn)移性、革蘭氏陰性菌質(zhì)粒兩個(gè)茄子主要類別:接合型質(zhì)粒在自然條件下,可以自發(fā)地從一個(gè)細(xì)胞遷移(接合作用)到另一個(gè)細(xì)胞(例如F、Col、R質(zhì)粒等)。鄭智薰連接質(zhì)粒在自然條件下不能獨(dú)立地進(jìn)行結(jié)合作用。例如:Col,r的其他成員是一些鄭智薰結(jié)合質(zhì)粒(ColE1),在結(jié)合型質(zhì)粒的存在和幫

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