1.2 基因工程的基本操作程序ppt課件.ppt

1、1.2 基因工程的基本操作程序,1,2,3,步驟一：目的基因的獲取,目的基因主要是指編碼蛋白質的結構基因。是人們所需要轉移或改造的基因。,如蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因，植物的抗逆性相關的基因，以及人的胰島素基因、干擾素基因等。,從已有的物種中分離 人工方法合成,從基因文庫獲得,4,1、從基因文庫中獲取目的基因,基因文庫: 將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導入受體菌的群體中儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同的基因，稱為基因文庫(gene library)。 基因組文庫: 基因文庫中包含了一種生物所有的基因，這種基因文庫叫做基因組文庫。 部分基因文庫: 基因文庫中包含了一種生物的一部分基

2、因，這種基因文庫叫做部分基因文庫。,5,6,某生物體內全部DNA,許多DNA片段,受體菌群體,基因組文庫,某種生物某個時期的mRNA,cDNA,受體菌群體,部分基因文庫 （cDNA文庫）,7,外顯子,內含子,原核生物基因,真核生物基因,內含子,外顯子,8,真核生物cDNA文庫與的區(qū)別基因組文庫,小,大,無,有,無,有,某種生物部分基因,某種生物全部基因,可以,部分基因可以,9,2、利用PCR技術擴增目的基因,聚合酶鏈式反應，在生物體外復制特定DNA片段的核酸合成技術?？梢垣@得大量的目的基因。,10,循環(huán)（重復）,使目的基因短時間內成百萬倍地擴增,11,PCR技術的原理：DNA復制(體外),過程

3、：變性 退火 延伸,（解鏈為單鏈） （冷卻） （子鏈合成）,條件： 引物（2種）； 模板:DNA的兩條鏈； 四種脫氧核苷酸； 熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Taq酶）。,多次重復,12,PCR技術與DNA體內復制的區(qū)別：,需要,需要,常溫條件、解旋酶、ATP,高溫條件（9095）,DNA解旋酶、DNA聚合酶、,耐高溫的Taq酶,體內（細胞內）,體外,13,練習有關PCR技術的說法，不正確的是( ） APCR是一項在生物體外復制特定的DNA片段的核酸合成技術 BPCR技術的原理是DNA雙鏈復制 C利用PCR技術獲取目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列 DPCR擴增中必須有解旋酶才能解開雙鏈DN

4、A,14,（1）催化過程的酶是_ 。 （2）過程也稱為DNA的變性，此過程在溫度高達9095時才能完成，說明DNA分子具有_性。 （3）由圖中信息分析可知，催化過程的酶都是_，兩者在作用特性上的區(qū)別是_ 。 （4）如果RNA單鏈中有堿基100個，其中A占25%，U占15%，則通過該過程合成的一個雙鏈DNA片段中有胞嘧啶_個。,反轉錄酶（或逆轉錄酶）,練習：1970年，特明和巴爾的摩證實了RNA病毒能依賴RNA合成DNA的過程，并發(fā)現(xiàn)了催化此過程的酶。下面為形成cDNA的過程和PCR擴增過程示意圖。請根據(jù)圖解回答下列問題：,穩(wěn)定,DNA聚合酶,催化過程的酶耐高溫,60,15,蛋白質的氨基酸序列,

5、mRNA的核苷酸序列,結構基因的核苷酸序列,推測,推測,目的基因,化學合成,3. 通過DNA合成儀化學方法直接人工合成,（基因比較小、核苷酸序列又已知）,16,步驟二：基因表達載體的構建（核心內容）,（1）用一定的限制酶切割質粒，使其出現(xiàn)一個切口，露出黏性末端。 （2）用同一種限制酶切割目的基因，使其產(chǎn)生相同的黏性末端。 （3）將切下的目的基因片段插入質粒的切口處，再加入適量DNA連接酶，形成了一個重組DNA分子（重組質粒）。,目的基因與運載體結合的過程實際上是不同來源的基因重組的過程。,17,步驟二：基因表達載體的構建（核心內容）,獲取目的基因,DNA連接酶,重組DNA,1. 表達載體的構建

6、過程,質粒,目的基因與運載體結合的過程實際上是不同來源的基因重組的過程。,18,步驟二：基因表達載體的構建（核心內容）,2. 表達載體的組成,啟動子：,+,目的基因：,+,終止子：,標記基因：,+,是 的結合位點， 驅動 過程。,RNA聚合酶,轉錄,終止 過程。,轉錄,有目的基因的受體細胞。,鑒定和篩選,編碼人類所需的蛋白質, 使生物表達相應性狀.,復制原點：,啟動復制,19,質粒,DNA分子,限制酶處理,兩個切口 獲得目的基因,DNA連接酶,重組DNA分子（重組質粒）,同一種,一個切口 兩個黏性末端,基因表達載體的組成 復制原點+啟動子+目的基因+終止子+標記基因,20,思考:,1. 上述表

7、達載體的啟動子、目的基因、終止子、標記基因的化學成分相同嗎？,都是DNA,2. 終止子和終止密碼的化學成分是否一致？,終止子DNA, 終止轉錄; 終止密碼RNA上，終止翻譯.,21,3. 圖為某種質粒表達載體簡圖，小箭頭所指分別為限制性內切酶EcoRI、BamHI的酶切位點，ampR為青霉素抗性基因，tctR 為四環(huán)素抗性基因，P啟動子，T為終止子，ori為復制原點。已知目的基因的兩端分別有包括EcoRI、BamHI在內的多種酶的酶切位點。,據(jù)圖回答： （1）將含有目的基因的DNA與質粒該表達載體分別 用EcoRI酶切，酶切產(chǎn)物用連接酶進行連接后，其中由 兩個DNA片段之間連接形成的產(chǎn)物有 、

8、 、 三種 。若要從這些連接產(chǎn)物中分離出重組質粒，需要對這些連接產(chǎn)物進 行 . （2）用上述3種連接產(chǎn)物與無任何抗藥性的原核宿主細胞進行轉化實驗。之后將這些宿主細胞接種到含青霉素的培養(yǎng)基中，能生長的原核宿主細胞所含有的連接產(chǎn)物是 ；,目的基因運載體連接物,運載體運載體連接物,目的基因目的基因連接物,分離純化,目的基因運載體連接物,運載體運載體連接物,22,練習. 圖為某種質粒表達載體簡圖，小箭頭所指分別為限制性內切酶EcoRI、BamHI的酶切位點，ampR為青霉素抗性基因，tctR 為四環(huán)素抗性基因，P啟動子，T為終止子，ori為復制原點。已知目的基因的兩端分別有包括EcoRI、BamHI在

9、內的多種酶的酶切位點。,（3）目的基因表達時，RNA聚合酶識別和結合的位點是 ，其合成的產(chǎn)物是 。 （4）在上述實驗中，為了防止目的基因和質粒表達載體在酶切后產(chǎn)生的末端發(fā)生任意連接，酶切時應選用的酶 是 。,EcoRI和BamHI,啟動子,mRNA,23,常用的受體細胞：,有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌、酵母菌和動植物細胞等。,將目的基因導入受體細胞的原理,借鑒細菌或病毒侵染細胞的途徑。,步驟三：目的基因導入受體細胞,轉化： 指目的基因進入受體細胞內，并且在受體細胞內維持穩(wěn)定和表達的過程。,24,1.將目的基因導入植物細胞,（1）農(nóng)桿菌轉化法：感染雙子葉植物和裸子植物，對大多單子葉植物沒有感

10、染力； （2）基因槍法：常用于單子葉植物； （3）花粉管通道法：轉基因抗蟲棉。,25,（2）基因槍法：常用于單子葉植物；,26,花的結構示意圖,1,2,3,4,5,6,7,8,9,花柄,花托,子房,花萼,花瓣,花柱,柱頭,花藥,花絲,雄蕊,雌蕊,（花冠）,（3）花粉管通道法：轉基因抗蟲棉。,27,28,2.將目的基因導入動物細胞,顯微注射技術： 利用微量注射器在顯微鏡下直接把目的基因注入宿主細胞。,3.將目的基因導入微生物細胞,導入大腸桿菌的方法: 首先用Ca2+ 處理細胞，以增大細菌細胞壁的通透性，使細胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)感受態(tài)細胞。 第二步是將重組表達載體DNA分

11、子溶于緩沖液中與感受態(tài)細胞混合，在一定的溫度下促進感受態(tài)細胞吸收DNA分子，完成轉化過程。,顯微注射技術,提純基因表達載體,29,采用氯化鈣來改變其通透性是為了制感受態(tài)細胞，原理是，用低滲CaCl2溶液在低溫（0）時處理快速生長的細菌，此時細菌膨脹成球形，外源DNA分子在此條件下易形成抗DNA酶的羥基鈣磷酸復合物粘附在細菌表面，通過熱激作用促進細胞對DNA的吸收。,蔡信之微生物學181頁，兩種理論都是假說，1、局部原生質化，也就是細胞壁上出現(xiàn)孔，2、好像還涉及細胞表面的轉化因子（分子量5000-1-0000）的蛋白質的形成和細胞表面受體結合的轉運問題。,劉祖洞得遺傳書下冊，174頁，用鈣離子處

12、理使細胞膜上出現(xiàn)漏隙，DNA容易進入。,30,目前常用的對原核細胞的轉化方法有兩類：電穿孔轉化法、化學轉化法。電穿孔轉化法屬于物理方法，不需要對細胞進行特殊處理，但由于受到儀器的限制，實驗室更常用的是化學轉化法?；瘜W轉化法是利用低溫（0）和氯化鈣（CaCl2）低滲溶液的理化處理使宿主細胞處于容易吸收外源DNA的狀態(tài)，即感受態(tài)（competence），此時菌體膨脹成球形，細胞壁和膜的通透性增強。重組DNA與Ca2+形成的羥基-磷酸鈣復合物黏附于菌體表面，經(jīng)42短暫的熱沖擊處理（熱休克）后，黏附表面的重組DNA被吸收進入宿主細胞。然后在營養(yǎng)豐富的的培養(yǎng)基上生長1小時左右，細胞形態(tài)復原，進入增殖分裂

13、期。,體外重組的DNA分子，需按一定的方式導入宿主細胞，通過宿主細胞的復制而使目的基因得到大量的擴增。宿主細胞也稱為受體細胞，分為原核細胞和真核細胞兩類。原核細胞以大腸桿菌為主，真核細胞包括酵母及動物細胞等。重組分子導入適宜的宿主細胞的過程就是轉化。在基因克隆技術中，轉化(transformation)特指質粒DNA或以它為載體構建的重組子導入宿主細胞的過程。,大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備（氯化鈣法）及轉化,31,細胞壁厚度因細菌不同而異，一般為15-30nm。主要成分是肽聚糖，由N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸構成雙糖單元，以（1-4）糖苷鍵連接成大分子。N-乙酰胞壁酸分子上有四肽側鏈，相鄰聚糖纖

14、維之間的短肽通過肽橋（革蘭氏陽性菌）或肽鍵（革蘭氏陰性菌）橋接起來，形成了肽聚糖片層，像膠合板一樣，粘合成多層。 肽聚糖中的多糖鏈在各物種中都一樣，而橫向短肽鏈卻有種間差異。革蘭氏陽性菌細胞壁厚約2080nm，有15-50層肽聚糖片層，每層厚1nm，含20-40的磷壁酸（teichoic acid），有的還具有少量蛋白質。革蘭氏陰性菌細胞壁厚約10nm，僅2-3層肽聚糖，其他成分較為復雜，由外向內依次為脂多糖、細菌外膜和脂蛋白。此外，外膜與細胞之間還有間隙。 肽聚糖是革蘭陽性菌細胞壁的主要成分，凡能破壞肽聚糖結構或抑制其合成的物質，都有抑菌或殺菌作用。如溶菌酶是N-乙酰胞壁酸酶，青霉素抑制轉肽

15、酶的活性，抑制肽橋形成。 細菌細胞壁的功能包括：保持細胞外形；抑制機械和滲透損傷（革蘭氏陽性菌的細胞壁能耐受20kg/cm2的壓力）；介導細胞間相互作用（侵入宿主）；防止大分子入侵；協(xié)助細胞運動和分裂。 脫壁的細胞稱為細菌原生質體（bacterial protoplast）或球狀體（spheroplast，因脫壁不完全），脫壁后的細菌原生質體，生存和活動能力大大降低。,32,1、檢測與鑒定的目的,目的基因進入受體細胞后，是否可以穩(wěn)定維持 和表達其遺傳特性。,步驟四：目的基因的檢測與鑒定,2、分子水平的檢測 檢測是否插入了目的基因 檢測是否轉錄出了mRNA 檢測是否翻譯成蛋白質 3、個體生物學水

16、平的檢測 做抗蟲或抗病的接種實驗,抗原-抗體雜交,DNA分子雜交技術,DNA-RNA分子雜交技術,33,34,DNA,附著在膜上,硝化纖維素,加探針,報告基因（含熒光素分子）,變性,DNA雜交 （如檢測SARS病毒等）,a,b,c,d,35,不能，受體細胞必須表現(xiàn)出特定的性狀，才能說明目的基因完成了表達。,受體細胞攝入DNA分子后，就說明目的基因完成了表達嗎？,若不能表達，要對抗蟲基因再進行修飾。,36,基因工程的基本操作程序,目的基因的獲取,基因表達載體的構建,將目的基因導入受體細胞,目的基因的檢測與鑒定,1、從基因文庫中獲取目的基因 2、利用PCR技術擴增目的基因 3、化學方法人工合成,復

17、制原點 + 目的基因 + 啟動子 + 終止子 + 標記基因,農(nóng)桿菌轉化法、基因槍法、花粉管通道法、顯微注射法、Ca2+處理法,DNA分子雜交技術、分子雜交技術、抗原抗體雜交技術,分子檢測外的個體水平鑒定,37,1.以下說法正確的是 （ ） A.所有的限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列 B.質粒是基因工程中唯一的運載體 C.運載體必須具備的條件之一是：具有多個限制酶切點，以便與外源基因連接 D.基因控制的性狀都能在后代表現(xiàn)出來 2.有關基因工程的敘述中，錯誤的是 （ ） A.DNA連接酶將黏性末端的堿基對連接起來 B.限制性核酸內切酶用于目的基因的獲得 C.目的基因須由運載體導入受體細胞 D.人

18、工合成目的基因不用限制性核酸內切酶,C,練習,A,3.在遺傳工程技術中,下列何種目的基因一般以直接分離的方法獲得 A.人的胰島素基因 B.蠶的蠶絲蛋白基因 C.芽孢桿菌的抗蟲基因 D.菜豆儲藏蛋白基因,C,38,D,4.不屬于質粒被選為基因運載體的理由是 （ ） A.能復制 B.有多個限制酶切點 C.具有標記基因 D.它是環(huán)狀DNA 5.有關基因工程的敘述正確的是 （ ） A.限制酶只在獲得目的基因時才用 B.重組質粒的形成在細胞內完成 C.質粒都可作為運載體 D.蛋白質的結構可為合成目的基因提供資料 6.基因工程是在DNA分子水平上進行設計施工的。在基因操作的基本步驟中，不進行堿基互補配對的

19、步驟是 （ ） A.人工合成目的基因 B.目的基因與運載體結合 C.將目的基因導入受體細胞 D.目的基因的檢測和表達,D,C,39,40,1.利用大腸桿菌可以生產(chǎn)出人的胰島素，聯(lián)系前面有關細胞器功能的知識，結合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生產(chǎn)人的糖蛋白，可以用大腸桿菌嗎？,有些蛋白質肽鏈上有共價結合的糖鏈，這些糖鏈是在內質網(wǎng)和高爾基復合體上加工完成的，內質網(wǎng)和高爾基復合體存在于真核細胞中，大腸桿菌不存在這兩種細胞器，因此，在大腸桿菌中生產(chǎn)這種糖蛋白是不可能的。,2.-珠蛋白是動物血紅蛋白的重要組成成分。當它的成分異常時，動物有可能患某種疾病，如鐮刀形細胞貧血癥。假如讓你用基因工程的方法，使大腸桿菌生產(chǎn)出鼠的-珠蛋白，想一想，應如何進行設計？,尋根問底：,41,（1）從小鼠中克隆出-珠蛋白基因的編碼序列（cDNA）。 （2）將cDN