CRISPR.pptx

1、CRISPR/Cas介導(dǎo)的基因組定點(diǎn)編輯編輯技術(shù),2013年初，一種全新的人工核酸內(nèi)切酶clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/ CRISPR-associated(Cas)9基因改造系統(tǒng)出現(xiàn)，它主要是基于細(xì)菌的一種獲得性免疫系統(tǒng)改造而成，其特點(diǎn)是制作簡(jiǎn)單， 成本低，作用高效,CRISPR研究歷史,1987年，日本課題組在K12大腸桿菌的堿性磷酸酶基因附近發(fā)現(xiàn)串聯(lián)間隔重復(fù)序列，隨后的研究發(fā)現(xiàn)這種間隔重復(fù)序列廣泛存在于細(xì)菌和古細(xì)菌的基因組中,2002年，科學(xué)家將其正式命名為clustered regul

2、arly interspaced short palindromic repeats(CRISPR),2005年，三個(gè)研究小組均發(fā)現(xiàn)CRISPR的間隔序列(spacer)與宿主菌的染色體外的遺傳物質(zhì)高度同源，推測(cè)其功能可能與細(xì)菌抵抗外源遺傳物質(zhì)入侵的免疫系統(tǒng)有關(guān),2007年，Barrangou等首次發(fā)現(xiàn)并證明細(xì)菌可能利用CRSPR系統(tǒng)對(duì)抵抗噬菌體入侵,2008 年 ，Marraffini等又發(fā)現(xiàn)細(xì)菌CRISPR系統(tǒng)能阻止外源質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移，首次利用實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了CRISPR系統(tǒng)的功能，由此科學(xué)家們揭開(kāi)了研究CRISPR系統(tǒng)作用機(jī)制的序幕,CRISPR/Cas的基因座結(jié)構(gòu),3端為CRISPR基因座，由啟

3、動(dòng)子區(qū)域和眾多的間隔序列(spacers)和重復(fù)序列(direct repeats)順序排列組成,5端為tracrRNA基因,中間為一系列Cas蛋 白 編 碼 基 因 ， 包 括 Cas9, Cas1, Cas2和Csn2,接近90%的古細(xì)菌和40%的細(xì)菌的基因組或是質(zhì)粒中至少存在一個(gè)CRISPR基因座,CRISPR中的高度可變間隔序列主要來(lái)源于噬菌體或是質(zhì)粒，長(zhǎng)度范圍在21-72 bp，不同的CRISPR基因座包含的間隔序列的數(shù)量差異很大，從幾個(gè)到幾百個(gè)不等目前發(fā)現(xiàn)間隔序列數(shù)量最多的CRISPR存在于一種黏液細(xì)菌(DSM 14365)中 ，包含587個(gè)間隔序列,CRISPR中的重復(fù)序列長(zhǎng)度范

4、圍在21-48 bp，序列并非嚴(yán)格保守，甚至在同一個(gè)細(xì)菌內(nèi)的不同CRISPR基因座的重復(fù)序列也有不同，但它的5端和3端部分為保守序列，分別為GTTT/g和GAAAC 重復(fù)序列里還包含部分回文結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)錄出的RNA能形成穩(wěn)定且保守的二級(jí)結(jié)構(gòu)，可能在與Cas蛋白結(jié)合形成核糖核蛋白復(fù)合物的過(guò)程中發(fā)揮重要作用,CRISPR/Cas的免疫機(jī)制分為相對(duì)獨(dú)立的層次：,第一個(gè)層次 主要是對(duì)外來(lái)信息的處理和加工，形成免疫記憶，也就是新的間隔序列的獲得，主要由通用的核心蛋白Cas1和Cas2參與完成；,第二個(gè)層次 主要為初級(jí)CRISPR RNA成熟以及識(shí)別和降解入侵的外源遺傳物質(zhì),CRISPR的高度可變的間隔區(qū)(s

5、pacer)獲得,指外來(lái)入侵的噬菌體或是質(zhì)粒DNA的一小段DNA序列被整合到宿主菌的基因組，整合的位置位于CRRSPR的5端的兩個(gè)重復(fù)序列之間(repeats),噬菌體或是質(zhì)粒上與間隔序列對(duì)應(yīng)的序列被稱為protospacer，通常protospacer的5或是3端延伸幾個(gè)堿基序列很保守，被稱為PAM (protospacer adjacent motifs)，它的長(zhǎng)度一般為2-5堿基，一般與protospacer相隔1- 4堿基,首先識(shí)別入侵的核酸和掃描外源DNA潛在的PAM，將臨近PAM的序列作為候選protospacer;,然后在CRISPR基因座的5端合成重復(fù)序列；,最后新的間隔序列整

6、合到兩個(gè)重復(fù)序列之間,CRISPR的高度可變的間隔區(qū)(spacer)獲得,CRISPR/Cas系統(tǒng)分為： Type Type Type三種不同類型,Type系統(tǒng)的主要特征是包含一個(gè)標(biāo)志性的Cas9蛋白(分子質(zhì)量很大的多功能蛋白)參與crRNA的成熟以及降解入侵的噬菌體DNA或是外源質(zhì)粒,Cas9蛋白包含兩個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，一個(gè)在N端，有類似于Ruc核酸酶的活性，一個(gè)在中部有類似HNH核酸酶的活性,CRISPR/Cas系統(tǒng)編碼tracrRNA(trans-activating crRNA)，其指導(dǎo)RNase和Cas9完成前體crRNA的成熟 隨后tracrRNA還能與成熟的crRNA的重復(fù)序列配對(duì)形

7、成RNA二聚體，進(jìn)而和Cas9蛋白結(jié)合成核糖核蛋白復(fù)合體，發(fā)揮識(shí)別和降解入侵的外源DNA功能,Cas9 HNH結(jié)構(gòu)域切割互補(bǔ)DNA鏈，而RuvC樣結(jié)構(gòu)域切割非互補(bǔ)DNA鏈,CRISPR/Cas系統(tǒng)的影響因素,Cas9對(duì)系統(tǒng)的影響,tracrRNA在DNA識(shí)別的過(guò)程中是必須的，可能是參與tracrRNA與目標(biāo)DNA定向結(jié)合,tracrRNA對(duì)系統(tǒng)的影響,tracrRNA保留23-48bp的序列就能夠支持Cas9催化的DNA切割,crRNA5端截短10個(gè)堿基將會(huì)導(dǎo)致切割失敗，而從3端截短10個(gè)堿基不影響切割。,tracrRNA和crRNA完整性對(duì)系統(tǒng)的影響,Protospacer準(zhǔn)確性對(duì)系統(tǒng)的影響

8、,Protospaer序列越靠近3端準(zhǔn)確性越重要,PAM對(duì)系統(tǒng)的影響,Cas9 可以識(shí)別化學(xué)合成的單鏈RNA發(fā)揮作用。,CRISPR/Cas系統(tǒng)應(yīng)用的前提,CRISPR/Cas系統(tǒng)的作用特性與限制性核酸內(nèi)切酶相似，它對(duì)序列的特異性切割主要依賴于crRNA與Cas蛋白形成的核糖核蛋白復(fù)合物識(shí)別靶序列上的PAM 以 及protospacer,CRISPR/Cas系統(tǒng)在基因改造中的應(yīng)用,三 類CRISPR/Cas系統(tǒng)中，Type型系統(tǒng)的核糖核蛋白復(fù)合物相對(duì)簡(jiǎn)單，除crRNA和tracrRNA外，只有Cas9一個(gè)蛋白 目前，產(chǎn)膿鏈球菌(SF370)的Type型系統(tǒng)是被改造的最為成功的人工核酸內(nèi)切酶，已

9、經(jīng)在人類細(xì)胞 小鼠 斑馬魚(yú)中成功實(shí)現(xiàn)了基因組定點(diǎn)修飾,發(fā)現(xiàn)tracrRNA對(duì)靶點(diǎn)的識(shí)別和切割是必需的，tracrRNA的5端與成熟的crRNA 3端有部分序列(約13 bp)能夠配對(duì)進(jìn)而形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，對(duì)維持crRNA與靶點(diǎn)的配對(duì)可能十分重要 根據(jù)tracrRNA與crRNA的結(jié)構(gòu)特性，他們tracrRNA和crRNA表達(dá)為一條嵌合的向?qū)NA (guide RNA，gRNA)，并在體外證明gRNA可以發(fā)揮tracrRNA和crRNA的功能,哺乳動(dòng)物細(xì)胞中實(shí)驗(yàn),SpRNase III不是必須的,切割產(chǎn)生多種微缺失插入突變,兩個(gè)基因同時(shí)切割,CRISPR/Cas 系統(tǒng)可以介導(dǎo)一個(gè)基因的多重編輯,哺乳動(dòng)物ES細(xì)胞中實(shí)驗(yàn),基因敲除小鼠的獲得,雙基因敲除小鼠的獲得,NHEJ-介導(dǎo)的