成人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對臍血CD34+細(xì)胞的體外擴(kuò)增作用.doc

成人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對臍血CD34+細(xì)胞的體外擴(kuò)增作用作者：賈明峰,侯相麟,趙麗,劉蓓,李娟,陳軒【關(guān)鍵詞】骨髓細(xì)胞【Abstract】AIM:ToinvestigatetheeffectsofadultbonemarrowmesenchymalstemcellsontheexpansionofumbilicalcordbloodCD34+cellsexvivo.METHODS:Adultbonemarrowmesenchymalstemcellswereisolatedandculturedasfeederlayer.UmbilicalcordbloodCD34+cellswereculturedincombinationwithmesenchymalstemcells,stemcellfactor,Interleukin11andgranulocytemacrophagecolonystimulatingfactor,respectively.Attheendof3weeks,thetotalnumberofnucleatedcells,colonyformingcellsandCD34+cellswasrepeatedlycountedinculturesystemfor3weekstoobtainthefoldofexpansion.RESULTS:Themesenchymalstemcellsandcytokinescoculturesystemssignificantlyenhancedtheexpansionofthecordbloodcellswiththeincreaseofthetotalnumberofnucleatedcellsby114.22.4fold,colonyformingcellsby40.58.6foldandCD34+cellsby11.30.4fold,respectively.CONCLUSION:TheexpansionofumbilicalcordbloodCD34+cellscanbeenhancedexvivobyadultbonemarrowmesenchymalstemcellscombinedwithcytokines.【Keywords】exvivoamplification；CD34+cell；cordblood；bonecells；stemcells【摘要】目的：探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCS)對臍血CD34+細(xì)胞體外擴(kuò)增作用.方法：分離培養(yǎng)成人MSCS作為滋養(yǎng)層，聯(lián)合SCF,IL11和GMCSF分別組成對臍血CD34+細(xì)胞的不同擴(kuò)增體系，培養(yǎng)3wk后觀察臍血有核細(xì)胞、CFCs以及CD34+細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)的變化.結(jié)果：MSCS聯(lián)合細(xì)胞因子組較其他組培養(yǎng)體系對有核細(xì)胞總數(shù)、CFCs含量及CD34+細(xì)胞含量均具有明顯的擴(kuò)增作用，分別擴(kuò)增了114.22.4,40.58.6,11.30.4倍.結(jié)論：成人MSCS協(xié)同其他細(xì)胞因子可增強(qiáng)臍血CD34+細(xì)胞的體外擴(kuò)增作用.【關(guān)鍵詞】體外擴(kuò)增；CD34+細(xì)胞；臍血；骨髓細(xì)胞；干細(xì)胞0引言骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymalstemcells,MSCs）作為骨髓造血微環(huán)境中的一種重要細(xì)胞成分,近年來成為干細(xì)胞研究領(lǐng)域的一大熱點(diǎn).MSCs具有自我更新和多向分化潛能，在體外可被誘導(dǎo)分化為多種結(jié)締組織及部分來源于外胚層的組織，形成骨、軟骨、骨骼肌、腱、韌帶、真皮、脂肪、骨髓基質(zhì)和神經(jīng)1,2.此外，還分泌多種生長因子支持骨髓造血，藉此MSCs可在體外作為滋養(yǎng)細(xì)胞層進(jìn)行造血干/祖細(xì)胞擴(kuò)增.自臍血（umbilicalcordblood,UCB）中發(fā)現(xiàn)造血干細(xì)胞(hematopoieticstemcell,HSC)以來，臍血HSC移植用于治療惡性及非惡性血液病日益廣泛，但單份臍血所含的造血細(xì)胞不足以滿足成人的移植所需，大量擴(kuò)增后才能用于移植.鑒于此，我們探討了來自成人的MSCS對臍血CD34+細(xì)胞的體外擴(kuò)增作用.1材料和方法1.1材料正常成年男性獻(xiàn)骨髓者2例，健康足月分娩兒臍血14例,取自蘭州市慈和堂醫(yī)院和本院婦產(chǎn)科.Percoll分離液（密度1.073kg/L),淋巴細(xì)胞分離液（密度1.077kg/L）,馬血清（HS）均購自TBD公司；DMEMLG培養(yǎng)基購自PAALab(Germany)；IMDM購自Gibco公司；胎牛血清(FBS)為杭州四季青公司產(chǎn)品；BSA、甲基纖維素、巰基乙醇及L谷氨酰胺購自Sigma公司；重組人干細(xì)胞因子（rhSCF），重組人白細(xì)胞介素11（rhIL11）,重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（rhGMCSF），重組人粒細(xì)胞集落刺激因子（rhGCSF）,重組人紅細(xì)胞生成素（rhEPO）均購自Peprotech公司；熒光標(biāo)記的抗CD34單克隆抗體（CD34PE）購自CoulterImmunotech公司；抗CD29,CD44,CD45和抗HLADR單克隆抗體購自PharMingen公司.1.2方法1.2.1MSCs的分離純化及培養(yǎng)MSCs的分離純化及培養(yǎng)按文獻(xiàn)3介紹的方法進(jìn)行.收集正常肝素抗凝骨髓約10mL，用Percoll溶液梯度離心,900g30min,收集中間相為有核細(xì)胞,然后將細(xì)胞按2108/L密度接種于DMEMLG培養(yǎng)基(含100mL/LFBS,L谷氨酰胺，青霉素105u/L，慶大霉素8104u/L)的塑料培養(yǎng)瓶中，37,50mL/LCO2飽和濕度孵箱中培養(yǎng),72h后更換培養(yǎng)基,以后每34d換液一次.當(dāng)貼壁細(xì)胞達(dá)90%以上融合時，用2.5g/L胰酶0.2g/LEDTA消化后傳代培養(yǎng).傳代第3代以后用于以下實(shí)驗.1.2.2MSCs表面分子測定用2.5g/L胰酶0.2g/LEDTA消化收獲細(xì)胞,至少2105個細(xì)胞與抗CD29,CD44,CD45,HLADR抗體室溫反應(yīng)30min，PBS洗滌2次，后與FITC標(biāo)記的二抗避光反應(yīng)15min.細(xì)胞洗滌后懸浮于PBS中，CoulterEpicsXL流式細(xì)胞儀分析相關(guān)數(shù)據(jù).1.2.3臍血的采集、單個核細(xì)胞分離及CD34+細(xì)胞含量測定收集正常足月新生兒臍血,4保存運(yùn)輸,于4h內(nèi)用淋巴細(xì)胞分離液分離單個核細(xì)胞（mononuclearcells,MNC）.取100LMNC懸液上機(jī)檢測CD34+細(xì)胞含量，具體方法是：取陰性對照（MouseIgG1）與熒光標(biāo)記的CD34單抗（CD34PE）各20L于試管底部，再分別加入100L細(xì)胞懸液室溫避光孵育15min，后用QPrep(全血細(xì)胞制備儀)處理細(xì)胞，于測試管內(nèi)加100LFlowCount（熒光微球），混勻后用流式細(xì)胞儀分析.1.2.4細(xì)胞擴(kuò)增分組和臍血MNC,CD34+細(xì)胞體外培養(yǎng)根據(jù)培養(yǎng)體系中有否滋養(yǎng)層及是否添加細(xì)胞因子組合分為以下3組：A組為無滋養(yǎng)層加細(xì)胞因子，即MNC+SCF+IL11+GMCSF；B組為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞滋養(yǎng)層無細(xì)胞因子，即MNC+MSC；C組為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞滋養(yǎng)層加細(xì)胞因子，即MNC+MSC+SCF+IL11+GMCSF.臍血MNC,CD34+細(xì)胞培養(yǎng)在24孔培養(yǎng)板中進(jìn)行，培養(yǎng)體系為：IMDM中含125mL/LFBS,125mL/L馬血清，各種人細(xì)胞生長因子（SCF50g/L,IL1150g/L,GMCSF2g/L）.臍血MNC,CD34+細(xì)胞與MSC共培養(yǎng)體系為：MNC按1.01011/L接種于鋪滿MSCs滋養(yǎng)層的24孔板中，每孔1mL,33,50mL/LCO2和飽和濕度的培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)3wk.每周半量換液，并計數(shù)有核細(xì)胞（nucleatedcells,NC）總數(shù)、作集落培養(yǎng)及擴(kuò)增細(xì)胞中CD34+細(xì)胞含量測定.1.2.5造血祖細(xì)胞集落培養(yǎng)用甲基纖維素半固體集落培養(yǎng)法測定擴(kuò)增細(xì)胞集落形成能力，培養(yǎng)體系為：IMDM中含300mL/LHS,10g/LBSA,2mmol/LL谷氨酰胺,110-4mol/L巰基乙醇（2MP）,rhSCF50g/L,IL1150g/L,GMCSF20g/L,GCSF20g/L,EPO3000u/L和9g/L甲基纖維素.培養(yǎng)在24孔培養(yǎng)板中進(jìn)行，37,50mL/LCO2和飽和濕度條件下連續(xù)培養(yǎng)14d.每周在倒置顯微鏡下直接計數(shù)集落形成細(xì)胞（colonyformingcells,CFCs），40個細(xì)胞為1個集落.統(tǒng)計學(xué)處理:數(shù)據(jù)用xs表示，采用SPSS8.0統(tǒng)計軟件作重復(fù)測量資料的方差分析，P<；0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義.2結(jié)果2.1MSC的形態(tài)學(xué)特征及表面抗原特性經(jīng)Percoll分離液分離后培養(yǎng)的骨髓單個核細(xì)胞，大部分于24h內(nèi)即貼壁，倒置顯微鏡下，細(xì)胞呈圓形有小的胞質(zhì)突起.72h后，大多數(shù)細(xì)胞有胞質(zhì)突起.1wk后以梭形細(xì)胞為主，胞質(zhì)豐富，核大，核染色質(zhì)細(xì)，核仁明顯.以后隨傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞擴(kuò)增顯著，呈成纖維細(xì)胞樣形態(tài)，平行排列生長或似漩渦狀.流式細(xì)胞儀測定F3代MSC表面分子顯示，CD34,CD45,HLADR等為陰性，CD29,CD44等為陽性，并且傳代前后MSC形態(tài)及表面標(biāo)志一致.2.2臍血中MNC總數(shù)、CD34+細(xì)胞含量測定本組14份標(biāo)本中有核細(xì)胞含量個體差異較大，其中MNC總數(shù)為（6.362.12）109/L參考值范圍（2.2415.80）109/L，流式細(xì)胞儀檢測的CD34+細(xì)胞含量為（21.22.9）106/L參考值范圍（13.730.2）106/L，體積差異也較大，中位體積55mL（參考值范圍35120mL）.2.3MSC對臍血NC總數(shù)、CFCs的擴(kuò)增作用不同的擴(kuò)增體系在體外連續(xù)觀察3wk，結(jié)果顯示：A組到C組NC總數(shù)均得到不同程度的擴(kuò)增（Tab1），其中C組擴(kuò)增最為明顯，與最初所接種細(xì)胞相比，于培養(yǎng)第1,2和3周分別擴(kuò)增7.61.1,41.51.3,114.22.4倍，并且與A組和B組分別比較，有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義（P<；0.05）.臍血中的CD34+細(xì)胞多為較早期的造血干/祖細(xì)胞，故CFC的含量較低.在2wk的體外培養(yǎng)過程中，各組CFC產(chǎn)率不盡相同（P<；0.05），并且它們的擴(kuò)增倍數(shù)在第2周達(dá)到較高值（Tab1），其中C組擴(kuò)增倍數(shù)達(dá)40.58.6.表13組擴(kuò)增體系對臍血NC,CFCs擴(kuò)增倍數(shù)（略）2.4MSC對臍血CD34+細(xì)胞的擴(kuò)增作用于培養(yǎng)的第1,2和3周分別取臍血MNC，用PECD34單克隆抗體標(biāo)記，流式細(xì)胞術(shù)熒光微球標(biāo)記法檢測其中CD34+細(xì)胞的含量.結(jié)果表明，不同組別CD34+細(xì)胞總數(shù)均得到不同程度擴(kuò)增，而C組的擴(kuò)增效果明顯優(yōu)于其他兩組（P<；0.05），CD34+細(xì)胞于第2周和第3周分別擴(kuò)增（11.30.4）倍和（6.11.1）倍（Fig1）.3討論目前認(rèn)為MSC是基質(zhì)細(xì)胞的前體細(xì)胞，參與構(gòu)成骨髓造血微環(huán)境，其調(diào)節(jié)造血的機(jī)制是通過MSC與造血干細(xì)胞的密切接觸以及各類造血生長因子的作用完成的.Majumdar等4檢測人MSC的基因表達(dá)及不同誘導(dǎo)條件下MSC細(xì)胞因子的表達(dá)水平變化及其對HSC的支持作用發(fā)現(xiàn)，MSC表達(dá)IL11,LIF,MCSF及SCF的mRNA.這些細(xì)胞因子都是很重要的造血生長因子，它們是MSC參與造血調(diào)控、支持造血的物質(zhì)基礎(chǔ).近年來臍帶血HSC移植的例數(shù)在逐年增加，但由于單份臍血所含造血細(xì)胞數(shù)量少，不能滿足成人患者移植的需要，故許多研究者嘗試通過各種體外擴(kuò)增的方法提高臍血移植的細(xì)胞數(shù).本研究基于MSC體外支持長期造血的特性，外加細(xì)胞因子觀察了其對臍血CD34+細(xì)胞的體外擴(kuò)增作用.MSC經(jīng)分離、培養(yǎng)和純化三代后用作飼養(yǎng)層，根據(jù)是否加用SCF,IL11和GMCSF分為三組不同擴(kuò)增體系培養(yǎng)3wk，結(jié)果各組對NC,CFCs和CD34+細(xì)胞均有不同程度的擴(kuò)增.MSC加細(xì)胞因子組較MSC組和單純細(xì)胞因子組的造血細(xì)胞總數(shù)和CFC明顯增多，有核細(xì)胞總數(shù)擴(kuò)增倍數(shù)最高可達(dá)(114.22.4)倍，CFC擴(kuò)增倍數(shù)第2周達(dá)(40.58.6)倍.在對CD34+細(xì)胞擴(kuò)增的動態(tài)觀察中采用流式細(xì)胞儀CD34+細(xì)胞絕對定量法，較為精確地測定了臍血有核細(xì)胞中CD34+細(xì)胞含量在擴(kuò)增前后的變化，各組CD34+細(xì)胞總數(shù)在第2周均達(dá)最高，其中以MSC加細(xì)胞因子組對CD34+細(xì)胞擴(kuò)增作用最強(qiáng)，CD34+細(xì)胞總數(shù)在第2周擴(kuò)增(11.30.4)倍，明顯高于其他兩組（Fig1）.臍血CD34+細(xì)胞于第2周后含量下降，可能是向定向祖細(xì)胞發(fā)生了分化，但其絕對計數(shù)仍顯著高于分離培養(yǎng)前.MSC體外擴(kuò)增臍血造血干細(xì)胞關(guān)鍵是要建立好滋養(yǎng)層.實(shí)驗中發(fā)現(xiàn)，MSC最初1wk內(nèi)生長緩慢，需10d左右達(dá)90%以上融合，此時傳代后細(xì)胞生長迅速，5d后即達(dá)80%以上融合，到第3代以后MSC生長漸趨穩(wěn)定，流式細(xì)胞儀檢測顯示不表達(dá)造血細(xì)胞的標(biāo)志，故本實(shí)驗選用了第3代以后的MSC.隨著基因工程的發(fā)展，各種重組造血生長因子廣泛用于臍血造血干/祖細(xì)胞的體外擴(kuò)增.SCF是原癌基因ckit的配體，是一種作用于最早期造血干/祖細(xì)胞的造血生長因子，在維持造血細(xì)胞存活，促進(jìn)造血細(xì)胞增殖分化，調(diào)控各系造血細(xì)胞的生長發(fā)育中起重要作用.SCF單獨(dú)作用刺激造血細(xì)胞增殖和促進(jìn)克隆形成的能力都很微弱，而與其他細(xì)胞因子有明顯協(xié)同促進(jìn)造血功能等作用.IL11能與多種其他細(xì)胞因子協(xié)同支持造血細(xì)胞前體細(xì)胞長期生長，對淋巴系、髓系、紅細(xì)胞系和巨核細(xì)胞系都具有促進(jìn)生長作用，尤其對巨核細(xì)胞系作用明顯，能顯著增加血小板的數(shù)量5.GMCSF對粒細(xì)胞系和單核細(xì)胞系細(xì)胞均有促進(jìn)生長、誘導(dǎo)分化的功能，并維持造血前體細(xì)胞和成熟細(xì)胞的存活.以上三種細(xì)胞因子加上MSC滋養(yǎng)層構(gòu)成了臍血CD34+細(xì)胞擴(kuò)增的強(qiáng)大物質(zhì)基礎(chǔ)，使臍血CD34+細(xì)胞得到有效擴(kuò)增.我們選用流式細(xì)胞儀熒光微球標(biāo)記法測定臍血MNC中CD34+細(xì)胞的含量，較以往測定CD34+細(xì)胞的百分率更簡便、精確，值得在臨床造血干細(xì)胞移植中推廣使用.盡管臍帶血干細(xì)胞移植已有十幾年的歷史，研究者在臍血干細(xì)胞擴(kuò)增方面做了大量的實(shí)驗研究，但目前很少見到利用擴(kuò)增的臍血造血干細(xì)胞臨床移植成功的報道，這一課題仍需要作進(jìn)一步的探討.【參考文獻(xiàn)】1DengW，ObrockaM，F(xiàn)ischerI，etal.InvitrodifferentiationofhumanmarrowstromalcellsintoearlyprogenitorsofneuralcellsbyconditionsthatincreaseintracellularcyclicAMPJ.JBiochemBiophysResCommun,2001；282:148-152.2MingullJJ,CongetP,EricesA.Biologyandclinicalutilizat