【畢業(yè)學(xué)位論文】（Word原稿）秸稈腐熟菌劑的細(xì)菌種群分析及其腐熟過程的動(dòng)態(tài)研究微生物分子生態(tài)學(xué)碩士論文

密級(jí)： 論文編號(hào)： 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩士學(xué)位論文 秸稈 腐熟菌劑的 細(xì)菌 種群分 析 及 其 腐熟過程的 動(dòng)態(tài)研究 in in I 摘 要 本論文以秸稈腐熟菌劑為研究對(duì)象，分別采用 分子生物學(xué)方法和 傳統(tǒng)平板分離方法對(duì)其細(xì)菌 菌群及在腐熟過程中的變化 進(jìn)行分析。 采 用 構(gòu)建 16S 隆文庫(kù) 的方法比 傳統(tǒng)平板分離方法能夠更加客觀、準(zhǔn)確的反應(yīng) 腐熟劑 樣品 中 細(xì)菌組成 ， 術(shù) 是目前 研究 接種微生物 在腐熟過程中 動(dòng)態(tài) 變化 的理想方法之一。本 論文 研究可為 秸稈腐熟 菌劑的 菌種 合理組成、 菌劑 生產(chǎn) 與 應(yīng)用提供依據(jù) 。 論文的主要結(jié)果如下。 采用 構(gòu)建 16S 隆文庫(kù)的方法研究 了 目前廣泛應(yīng)用的 樣品 A 和 B 的細(xì)菌組成， 結(jié)果 表明 樣品 A 主要是融合乳桿菌（ 枯草芽孢桿菌（ 短小芽孢桿菌（ ； 而 樣品 B 主要是布氏乳桿菌（ 香腸乳桿菌（ 耐酸乳桿菌（ 。 對(duì)比平板分離法， 采用構(gòu)建 16S 庫(kù)的方法 得到的結(jié)果 更全面， 也更好反映出 樣品 中 的細(xì)菌組成。 堆漚和凼漚 這兩種發(fā)酵方式的優(yōu)勢(shì)微生物存在較大的差異。但是 都是堆漚方式的兩個(gè)樣品 的 目的條帶 測(cè)序結(jié)果與產(chǎn)品建庫(kù)測(cè)定結(jié)果相比較，測(cè)序結(jié)果均非所加 秸稈腐熟劑 優(yōu)勢(shì)細(xì)菌 。 將樣品 A 和 B 接種 水稻 秸稈 小型 堆 肥 中 ， 采用 方法和平板培養(yǎng)的方法分析堆肥中的微生物動(dòng)態(tài)變化，并測(cè)定 堆 腐過程中的溫度、 、含水量、 C/N、種子發(fā)芽率等 參數(shù) 。 實(shí) 驗(yàn)結(jié)果表明，添加 秸稈 腐熟劑可以促進(jìn)堆肥順利進(jìn)行 ； 堆肥中微生物發(fā)生明顯演替，首先是乳酸菌和常溫細(xì)菌大量繁殖， 促進(jìn) 堆溫升高，進(jìn)入高溫期后高溫放線菌和高溫細(xì)菌 快速 繁殖，在腐熟后期堆溫下降后，常溫菌又重新繁殖。 采用 譜分析其過程中優(yōu)勢(shì)微生物， 結(jié)果表明 堆 腐 過程中不同時(shí)期 是不同 優(yōu)勢(shì)菌種扮演重要角色 以 促進(jìn)秸稈順利腐熟。 并 且目的條帶測(cè)序結(jié)果表明，堆肥中優(yōu)勢(shì)菌種大多為目前不可培養(yǎng)微 生物，并非 添加 樣品中所含 優(yōu)勢(shì) 微生物 。 本研究表明 ： 16S 隆文庫(kù)法 和 可以用于微生物菌劑中的細(xì)菌組成分析， 快速準(zhǔn)確檢測(cè)菌劑質(zhì)量，這 對(duì)于微生物菌劑質(zhì)量的提高，推進(jìn)微生物肥料行業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重大意義 ； 堆肥過程 是由多個(gè)不同菌群主導(dǎo)的 接力 過程 ， 腐熟劑對(duì)初期的腐熟溫度的提高起到關(guān)鍵作用 ， 隨著腐熟進(jìn)程的深入，微生物菌群發(fā)生了更替 。 方法適 合 大批量 提取。 方法分析 復(fù)雜微生物樣品需要通過垂直電泳先確定變性 劑濃度的大致范圍。 關(guān)鍵詞 ： 秸稈 腐熟劑； 16S 隆文庫(kù)； 菌組成； n of by 6S is is of to of in of of of of as 6S of of of 6S in of of of of s of At we as pH, of go on in of at to at of of in of in t in 16S be in of of NA be in 16S 錄 第一章 緒 論 . 1 秸稈及其應(yīng)用現(xiàn)狀 . 1 秸稈還田與堆肥化處理 . 3 稈堆肥化處理 . 3 肥重要影響因素 . 4 秸稈腐熟菌劑研究進(jìn)展 . 6 堆肥中的微生物生態(tài)學(xué)過程 . 8 分子生態(tài)學(xué)在微生物多樣性研究中的應(yīng)用現(xiàn)狀 . 9 增與多態(tài)分析及核苷酸序列分析 . 9 . 9 本論文研究的意義和目的 . 11 本論文研究的內(nèi)容、方法和技術(shù)路線 . 11 論文研究?jī)?nèi)容和方法 . 11 論文研究所采用的技術(shù)路線 . 12 第二章 16S 隆文庫(kù)法分析秸稈腐熟菌劑細(xì)菌組成 . 13 實(shí)驗(yàn)材料 . 13 稈腐熟菌劑 . 13 要儀器設(shè)備 . 13 研究所用的其它菌株、質(zhì)粒和引物 . 13 養(yǎng)基 . 14 沖液和試劑 . 16 取試劑 . 16 實(shí)驗(yàn)方法 . 17 提取 . 17 度與純度的測(cè)定 . 18 6S 增及 物純化 . 18 物的連接 . 19 化 . 19 陽性克隆的篩選 . 19 型 . 20 建克隆文庫(kù) . 20 結(jié)果與分析 . 21 品總 取結(jié)果 . 21 6S 增結(jié)果及 增結(jié)果 . 22 性克隆的篩選與檢測(cè) . 23 型結(jié)果 . 23 建克隆文庫(kù)結(jié)果 . 25 個(gè)樣品組成菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹狀圖 . 27 用菌落平板計(jì)數(shù)法測(cè)定的樣品結(jié)果 . 30 本章小結(jié) . 31 第三章 腐熟過程的細(xì)菌動(dòng)態(tài)變化研究 . 32 實(shí)驗(yàn)材料 . 32 樣 . 32 要儀器及試劑 . 32 實(shí)驗(yàn)方法 . 32 提取方法 . 32 6S 增及 物純化 . 33 . 33 泳 . 34 結(jié)果與分析 . 35 取結(jié)果 . 35 6S 增 . 35 果 . 36 直電泳變性劑濃度的確定 . 36 個(gè)樣品的 析結(jié)果和主要目的條帶的測(cè)序 . 37 本章小結(jié) . 38 第四章 水稻秸稈的小型堆肥試驗(yàn) . 39 實(shí)驗(yàn)材料 . 39 稻秸稈和秸稈腐熟菌劑 . 39 V 要儀器和試劑 . 39 實(shí)驗(yàn)方法 . 39 肥實(shí)驗(yàn)處理 . 39 腐過程測(cè)定的參數(shù)及其測(cè)定方法 . 40 板計(jì)數(shù)法分析堆肥微生物 . 41 肥樣品 取 . 41 肥樣品 譜 . 42 結(jié)果與分析 . 42 料的基本理化特性 . 42 肥外觀效果 . 42 肥各參數(shù)變化 . 43 板培養(yǎng)法測(cè)定堆肥微生物的結(jié)果 . 45 析結(jié)果 . 49 本章小結(jié) . 52 第五章 結(jié)論與討論 . 54 結(jié)論 . 54 討論與展望 . 55 參考文獻(xiàn) . 56 致 謝 . 60 作者簡(jiǎn)歷 . 61 文縮略表 英文縮寫 英文全稱 中文名稱 性梯度凝膠電泳 基對(duì) 氧核糖核酸 磷酸脫氧核糖核酸 二胺四乙酸 化乙錠 丙基 千堿基對(duì) 合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 二烷基硫 酸鈉 醋酸 沖液 （羥甲基）氨基甲烷 芐青霉素 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 1 第一章 緒 論 我國(guó)是農(nóng)業(yè)大國(guó)，各類農(nóng)作物秸稈資源十分豐富，秸稈年產(chǎn)量達(dá) 7 億多噸 （孫永明等， 2005）。隨著農(nóng)村經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和農(nóng)村能源問題的解決，秸稈不再作為燃料，農(nóng)作物在收割季節(jié)秸稈被集中燃燒的現(xiàn)象日益突出，不僅污染環(huán)境，危害人們的身體健康，而且煙霧彌漫，影響陸路交通和 飛行安全。因此，合理的開發(fā)利用農(nóng)作物秸稈顯得尤為重要。 秸稈還田 作為 一項(xiàng)重要的農(nóng)業(yè)管理措施，可以增加土壤有機(jī)碳的含量，而土壤有機(jī)碳水平的提高不僅是土壤肥力上升的重要指標(biāo)，同時(shí)也是目前全球變暖條件下，如何利用土壤碳截留減緩溫室效應(yīng)所追求的一個(gè)目標(biāo)，因此，秸稈還田具有重要的生產(chǎn)和生態(tài)效益（張慶忠等， 2006） 。 但 由于農(nóng)作物秸稈主要由纖維素 、 半纖維素和木質(zhì)素三大部分組成，自然狀態(tài)下難以被微生物分解 ， 所以秸稈直接還田后在土壤中被微生物分解轉(zhuǎn)化的周期長(zhǎng)，不能作為當(dāng)季作物肥源 。 此外， 在土壤有機(jī)質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中，秸稈還田后如果 碳氧比不適當(dāng) (一般土壤中 C： N=10： 1 或 11： 1)，微生物分解有機(jī)質(zhì)時(shí)， 會(huì) 爭(zhēng)奪土壤中的氮素，產(chǎn)生土壤與作物爭(zhēng) 氮現(xiàn)象。 而 將秸稈進(jìn)行堆肥后制成復(fù)合有機(jī)肥料 再還田 ， 則可以 克 服上述問題，不僅 可以 為農(nóng)田提供大量?jī)?yōu)質(zhì)的有機(jī)肥料，而且為農(nóng)村解決秸稈問題找到了一條無害化、資源化、變廢為寶的合理出路，因而具有很好的經(jīng)濟(jì)效益、環(huán)境效益和社會(huì)效益。 為了加快秸稈堆肥腐熟過程， 接種 秸稈腐熟劑 是一種必要的，也是行之有效的技術(shù)措施。要保證所使用的 秸稈腐熟劑 的促 進(jìn) 腐 熟的功效 ， 合理的菌群組成是前提。開展秸稈腐熟劑菌群組成的 研究 及其動(dòng)態(tài)變化 必不可少，具有重要的指導(dǎo)意義。 秸稈及其應(yīng)用現(xiàn)狀 我國(guó)是世界農(nóng)業(yè)大國(guó)，許多農(nóng)作物的總產(chǎn) 已 居世界前列，各種秸稈資源來源廣泛，數(shù)量巨大，據(jù)估算約有 七億 噸之多，是一項(xiàng)寶貴的農(nóng)業(yè)資源。長(zhǎng)期以來，農(nóng)作物秸稈在農(nóng)民生活和工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中充當(dāng)著重要的角色，農(nóng)民靠它建房蔽日遮雨，燒火做飯取暖，養(yǎng)畜積肥還田 ;同時(shí)，秸稈還是造紙業(yè)的主要原料。但隨著農(nóng)村經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和農(nóng)村能源問題的解決，出現(xiàn)了秸稈嚴(yán)重過剩的現(xiàn)象。在我國(guó)的一些玉米、小麥和水稻產(chǎn)地，每年夏秋季在收割季節(jié)的秸稈被大量焚燒，并且這種農(nóng)作物秸稈被集中焚燒的現(xiàn)象日益突出 。其惡果是 :破壞了生態(tài)平衡，造成土壤肥力衰竭，污染了環(huán)境 ;秸稈燃燒能利用率極低 (在 10% 以下 )，浪費(fèi)很大（ ， 2002）。不僅污染環(huán)境，危害人們的身體健康，而且煙霧彌漫，影響陸路交通和飛行安全。除了秸稈不再作為燃料外，隨著化肥施用量的增加和各種配合飼料的大量使用，農(nóng)民不再愿意費(fèi)事費(fèi)力用秸稈制作農(nóng)家肥或當(dāng)作飼料，而是直接使用化學(xué)肥料和精飼料，導(dǎo)致秸稈用作肥料和飼料的用量也越來越少。另外，秸稈作為工業(yè)原料的數(shù)量也在減少，其它方面的用量如建材等需用秸稈的量也沒有很大幅度的增加（陳展，2005）。因此， 隨著農(nóng)村經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，秸稈相對(duì)過剩這己成為一個(gè)全國(guó)性的問題。 隨著人口的增長(zhǎng)和人民生活水平的不斷提高，能源危機(jī)、食物短缺、環(huán)境污染等問題正日益嚴(yán)重地困擾著整個(gè)世界，尋找開發(fā)新能源、節(jié)省糧食、減少環(huán)境污染的有效途徑，顯得越來越重中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 2 要。而纖維素類物質(zhì)是世界上最豐富 (占全球總生物量 80%)、最廉價(jià)的資源之一，也是地球上最豐富的可再生資源。植物通過光合作用使光能以生物能的形式固定下來，其生成量每年高達(dá) 1000億噸，這些能量相當(dāng)于全球人類每年能源消耗量的 20 倍，食物中所含的能量的 200 倍，而且這些生物能可以年復(fù)一年通過自 然界的物質(zhì)循環(huán)生成，是永遠(yuǎn)不會(huì)枯竭的可再生資源（黃莉， 2006）。 秸稈主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素三大部分組成。纖維素是葡萄糖以 糖苷鍵結(jié)合形成的高分子化合物，包括葡萄糖單位 2000。 其葡萄糖亞基排列緊密有序，形成類似晶體的不透水的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，以及分子間結(jié)合不甚緊密、排列不整齊的無定形區(qū)域。 纖維素和半纖維素屬多糖物質(zhì)，是微生物所需要的能源和碳源。在適宜條件下，通過微生物的作用，只需幾周的時(shí)間就能分解掉其總量的 60 木質(zhì)素是芳香族化合物通過取代基以醚鍵和 聯(lián)結(jié)形成的高度無 規(guī)則三維生物大分子物質(zhì)。合成木質(zhì)素的單體有三種 ,三類木質(zhì)素結(jié)構(gòu)單元連接相似，由于分子大 (相對(duì)分子質(zhì)量 05)，溶解性差，沒有任何規(guī)則的重復(fù)單元或易被水解的鍵，所以木質(zhì)素分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜而不規(guī)則，由于含有各種生物學(xué)穩(wěn)定的復(fù)雜鍵型，因而微生物及其分解的胞外酶不易與之結(jié)合。與其他成分如纖維素、半纖維素等降解物不同，木質(zhì)素不含有易水解而重復(fù)的單元，并且對(duì)酶的水解作用呈抗性，是目前公認(rèn)的微生物難降解的芳香族化合物之一。 纖維素酶是降解纖維素生成葡萄糖的一組酶的總稱。一般將纖維素酶分為三類 ：（ 1） 內(nèi)切葡聚糖酶 (也 稱 或 )，這類酶作用于纖維素分子內(nèi)部的非結(jié)晶區(qū)，隨機(jī)水解 一糖苷鍵，將長(zhǎng)鏈纖維分子截?cái)?，產(chǎn)生大量非還原性末端的小分子纖維素 ；（ 2） 外切葡聚糖酶 (也稱 )，這類酶作用于纖維素分子的非還原端，依次水解 一糖苷鍵，每次切下一個(gè)纖維二糖分子 ；（ 3） 纖維二糖酶 (也稱 一葡聚糖苷酶 )，這類酶水解纖維二糖和短鏈的纖維寡糖生成葡萄糖 (杜秉海等， 1995)。目前，普遍接受的酶解機(jī)制是協(xié)同作用模型（ 等， 1990） ，認(rèn)為在協(xié)同降解過程中，首先由 在纖維素聚合物的內(nèi)部起作用 ，在纖維素的非結(jié)晶部位進(jìn)行切割，產(chǎn)生新的末端，然后再由 以纖維二糖為單位，從末端進(jìn)行水解，最后由 前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)微生物對(duì)纖維素的降解研究很多。國(guó)外在微生物對(duì)木質(zhì)纖維素降解方面的研究以單個(gè)種屬微生物 (如白腐真菌、木霉、曲霉等 )的添加為主，而對(duì)同時(shí)添加多種微生物研究的較少。 國(guó)內(nèi)研究方向主要集中在 纖維素分解菌 新菌株的選育及產(chǎn)酶調(diào)控機(jī)理等實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用方面。 如何將過剩的秸稈轉(zhuǎn)化為人類可利用的能源或物質(zhì)，一直是中外學(xué)者關(guān)注的課題。當(dāng)前秸稈的處置現(xiàn)狀主要有 :(1)機(jī)械化秸稈直接 還田：秸稈直接還田可增加土壤有機(jī)質(zhì)含量、培肥土壤，對(duì)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展有重要意義。 (2)秸稈肥料化：將秸稈進(jìn)行堆肥，利用微生物的分解作用將大分子長(zhǎng)鏈的有機(jī)物轉(zhuǎn)化為小分子的葡萄糖、氨基酸、脂肪酸等，并最終轉(zhuǎn)化為可被植物、動(dòng)物吸收和利用 無機(jī)鹽類等。堆肥產(chǎn)物作為有機(jī)肥料直接使用，將是今后秸稈高效利用的有效途徑之一。 (3)秸稈飼料化：秸稈通過青貯、氨化、膨化、壓塊和微生物發(fā)酵等多種方式制成飼料，用于養(yǎng)殖。 (4)秸稈制生物蛋白：利用微生物分解纖維素并吸收分解產(chǎn)物為其生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)，而后隨微生物體的 增殖，蛋白質(zhì) 的 量增加。這樣 就 可變 廢 纖維素為飼料，甚至食品。將這項(xiàng)技術(shù)用于解決糧食短缺，會(huì)有很好的前景。 (5)秸稈氣化：使秸稈在缺氧的情況下進(jìn)行燃燒，產(chǎn)生一氧化碳、氫氣、甲烷等可燃?xì)怏w，再通過輸配系統(tǒng)，輸送到各家各戶，用于炊事用能。 (6)以秸稈為原料養(yǎng)殖食用菌：利用秸稈中含有的豐富纖維素和木質(zhì)素等有機(jī)物培育食用菌 ， 既能獲得較高的經(jīng)濟(jì)效益，其培養(yǎng)基又可作優(yōu)質(zhì)的有機(jī)肥。 (7)工業(yè)原料：利用秸稈制造乙醇、淀粉等化工業(yè)的原中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 3 料。但是盡管秸稈有上述種種利用途徑，目前對(duì)纖維素資源的利用大約只占地球上總儲(chǔ)量的 之所以 利用率如此之低，主要是秸稈成分 纖維素水解為單糖這一關(guān)鍵性步驟受纖維素特殊的構(gòu)造所阻礙（張亞寧， 2004）。這不僅造成極大的資源浪費(fèi)，甚至對(duì)環(huán)境造成污染。 秸稈還田與堆肥化處理 我國(guó)農(nóng)民對(duì)作物秸稈的利用有 悠 久的歷史，只是由于從前 的 農(nóng)業(yè)生產(chǎn)水平低、產(chǎn)量低，秸稈數(shù)量少，秸稈除少量用于墊圈、喂養(yǎng)牲畜，部分用于堆漚肥外，大部分都作燃料 焚燒 。 隨著農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化的迅猛發(fā)展 ,秸稈還田特別是直接還田越來越受到重視。一方面是大規(guī)模的農(nóng)業(yè)生產(chǎn) ， 秸稈需要就近處理 ,以節(jié)省勞力 ； 另一方面 ， 長(zhǎng)期單純施用化肥不利 于 土壤肥力的發(fā)育 。在傳統(tǒng)的農(nóng)業(yè)耕作實(shí)踐中 ， 作為作物所需要養(yǎng)分的給源和土壤的改良劑 ， 秸稈一直都被腐解后施入農(nóng)田。但在自然條件下 ， 由于我國(guó)人均占有耕地少，復(fù)種指數(shù)高，倒茬間隔時(shí)間短，加之秸稈碳氮比高，不易腐爛。所以秸稈還田常因翻壓量過大，土壤水分不適，施氮肥不夠，翻壓質(zhì)量不好等原因，出現(xiàn)妨礙耕作，影響出苗，燒苗，病蟲害增加等現(xiàn)象，有的甚至造成減產(chǎn)。 因此秸稈直接還田目前只能用于少量秸稈的還田（史央， 2002）。而 將農(nóng)作物秸稈經(jīng)堆肥化處理 后 ， 再 將 堆肥產(chǎn)物 作為有機(jī)肥料 再還田 ， 則 是處理農(nóng)作物秸稈的有效方法之一。農(nóng)作物秸稈經(jīng)堆肥化處理后 有以下優(yōu)點(diǎn)：易分解的有機(jī)物大部分分解；施入土壤后不產(chǎn)生氮的生物固定；通過降解除去酚類等有害物質(zhì)，消