第四章 大環(huán)內(nèi)酯類抗生素

1、第四章第四章 大環(huán)內(nèi)酯類抗生素大環(huán)內(nèi)酯類抗生素 第一節(jié)第一節(jié) 概概 述述 大環(huán)內(nèi)酯類是以一個大環(huán)內(nèi)酯為母體，通大環(huán)內(nèi)酯類是以一個大環(huán)內(nèi)酯為母體，通 過羥基，以苷鍵和過羥基，以苷鍵和1 13 3個罕有的糖相聯(lián)結(jié)個罕有的糖相聯(lián)結(jié) 的一類抗生物質(zhì)的一類抗生物質(zhì)( (見圖見圖 4-14-1、圖圖4-24-2）。）。 大環(huán)內(nèi)酯類抗生素能抑制許多革蘭陽性菌大環(huán)內(nèi)酯類抗生素能抑制許多革蘭陽性菌 和某些革蘭陰性菌，對耐青霉素的葡萄球和某些革蘭陰性菌，對耐青霉素的葡萄球 菌和支原體有效，某些對螺旋體、立克次菌和支原體有效，某些對螺旋體、立克次 體和巨大病毒有效。體和巨大病毒有效。 根據(jù)大環(huán)內(nèi)酯結(jié)構(gòu)的不同，這類抗

2、生素又分為三根據(jù)大環(huán)內(nèi)酯結(jié)構(gòu)的不同，這類抗生素又分為三 類：多氧大環(huán)內(nèi)酯；多烯大環(huán)內(nèi)酯；蒽沙大環(huán)內(nèi)類：多氧大環(huán)內(nèi)酯；多烯大環(huán)內(nèi)酯；蒽沙大環(huán)內(nèi) 酯。酯。 1 1多氧大環(huán)內(nèi)酯抗生素多氧大環(huán)內(nèi)酯抗生素 按大環(huán)內(nèi)酯環(huán)的元素數(shù)，又分為按大環(huán)內(nèi)酯環(huán)的元素數(shù)，又分為1212、1414和和1616元環(huán)元環(huán) 三類。它們都是多功能團的分子，大部分都聯(lián)結(jié)三類。它們都是多功能團的分子，大部分都聯(lián)結(jié) 有有二甲胺基糖二甲胺基糖，因而顯示，因而顯示堿性堿性。有的不含二甲胺。有的不含二甲胺 基糖，只含中性糖，因而顯中性。作為醫(yī)療使用基糖，只含中性糖，因而顯中性。作為醫(yī)療使用 的多數(shù)是的多數(shù)是堿性堿性大環(huán)內(nèi)酯抗生素，重要的有大

3、環(huán)內(nèi)酯抗生素，重要的有1414元環(huán)元環(huán) 的的紅霉素紅霉素、竹桃霉素，、竹桃霉素，1616元環(huán)的螺旋霉素等。元環(huán)的螺旋霉素等。 此類抗生素的作用機理是與核糖蛋白體此類抗生素的作用機理是與核糖蛋白體50S50S亞基亞基 的特殊部位結(jié)合，的特殊部位結(jié)合，選擇性選擇性抑制原核細胞蛋白質(zhì)合抑制原核細胞蛋白質(zhì)合 成。對病原性細菌有選擇性抑制效應，因而其毒成。對病原性細菌有選擇性抑制效應，因而其毒 副作用較低。副作用較低。 2 2多烯大環(huán)內(nèi)酯抗生素多烯大環(huán)內(nèi)酯抗生素 其分子結(jié)構(gòu)特征是具有其分子結(jié)構(gòu)特征是具有26262828元大環(huán)內(nèi)酯，在多元大環(huán)內(nèi)酯，在多 元環(huán)內(nèi)酯環(huán)中，含有元環(huán)內(nèi)酯環(huán)中，含有4 47 7個共

4、軛雙鍵。該類抗生個共軛雙鍵。該類抗生 素多數(shù)同氨基糖相結(jié)合，由于結(jié)構(gòu)的不同，表現(xiàn)素多數(shù)同氨基糖相結(jié)合，由于結(jié)構(gòu)的不同，表現(xiàn) 出不同的生物活性。出不同的生物活性。 v多烯大環(huán)內(nèi)酯多烯大環(huán)內(nèi)酯抗生素對許多致病性真菌有不同的抗生素對許多致病性真菌有不同的 抑制作用，其抗菌活力隨抑制作用，其抗菌活力隨共軛雙鍵共軛雙鍵數(shù)目的增加而數(shù)目的增加而 增加。增加。 v此類抗生素可與真菌細胞膜的固醇類成分結(jié)合，此類抗生素可與真菌細胞膜的固醇類成分結(jié)合， 改變細胞膜的通透性，真菌細胞膜中都含有固醇，改變細胞膜的通透性，真菌細胞膜中都含有固醇， 而細菌細胞膜中則不含固醇。故此類抗生素可引而細菌細胞膜中則不含固醇。故此

5、類抗生素可引 起真菌細胞膜透性改變，導致致病菌死亡，而對起真菌細胞膜透性改變，導致致病菌死亡，而對 細菌無效細菌無效。 3 3蒽沙大環(huán)內(nèi)酯抗生素蒽沙大環(huán)內(nèi)酯抗生素 蒽沙大環(huán)內(nèi)酯抗生素又叫環(huán)橋類抗生素蒽沙大環(huán)內(nèi)酯抗生素又叫環(huán)橋類抗生素 ( (ansamycins) )，嚴格說來，不應屬于大環(huán)內(nèi)酯，嚴格說來，不應屬于大環(huán)內(nèi)酯 類。它們有著一個共同的結(jié)構(gòu)形態(tài)，都是一個類。它們有著一個共同的結(jié)構(gòu)形態(tài)，都是一個 脂肪鏈經(jīng)過酰胺鍵與平面的芳香基團的兩個不脂肪鏈經(jīng)過酰胺鍵與平面的芳香基團的兩個不 相鄰位置相聯(lián)結(jié)的環(huán)橋狀化合物，其結(jié)構(gòu)模型相鄰位置相聯(lián)結(jié)的環(huán)橋狀化合物，其結(jié)構(gòu)模型 示意見圖示意見圖4-24-2。

6、 v由于其脂肪鏈的結(jié)構(gòu)和立體化學與大環(huán)內(nèi)由于其脂肪鏈的結(jié)構(gòu)和立體化學與大環(huán)內(nèi) 酯類很相似，所以亦歸在此類抗生素中。酯類很相似，所以亦歸在此類抗生素中。 v此族抗生素抗菌譜較廣，還有抗癌活性。此族抗生素抗菌譜較廣，還有抗癌活性。 屬于該族的抗生素有屬于該族的抗生素有: :含有萘醌的抗生素，含有萘醌的抗生素， 如如利福霉素利福霉素、多利霉素、鏈伐立星等；含、多利霉素、鏈伐立星等；含 有苯醌的抗生素，如土塊霉素。有苯醌的抗生素，如土塊霉素。 第二節(jié)第二節(jié) 紅霉素紅霉素 紅霉素紅霉素( (erythromycin) )是是19521952年從紅霉素年從紅霉素 鏈霉菌鏈霉菌( (Str. erythre

7、us) )的培養(yǎng)液中分離出的培養(yǎng)液中分離出 來的一種堿性抗生素。后來從發(fā)酵液中又來的一種堿性抗生素。后來從發(fā)酵液中又 分離出紅霉素分離出紅霉素B B、C C、D D、E E等組分。其中以等組分。其中以 紅霉素紅霉素( (即紅霉素即紅霉素A)A)為主要組分，而為主要組分，而B B及及C C 在發(fā)酵液中也有一定數(shù)量。在發(fā)酵液中也有一定數(shù)量。 他們的抗菌譜相同，但抗菌活力不同，他們的抗菌譜相同，但抗菌活力不同， 其中以其中以A A為最強為最強，其他幾種組分都比，其他幾種組分都比A A小。小。 紅霉素紅霉素B B的體外抗菌活力只有紅霉素的體外抗菌活力只有紅霉素A A的的 75758585，紅霉素，紅霉

8、素C C和和D D約為約為5050，紅，紅 霉素霉素E E僅有僅有10101515的活性，因此在臨的活性，因此在臨 床上，所使用的是紅霉素床上，所使用的是紅霉素A A及其各種鹽類。及其各種鹽類。 一、一、結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu) 紅霉素紅霉素是由紅霉內(nèi)酯與去氧氨基己糖和是由紅霉內(nèi)酯與去氧氨基己糖和 紅霉糖縮合而成的堿性苷。紅霉內(nèi)酯環(huán)紅霉糖縮合而成的堿性苷。紅霉內(nèi)酯環(huán) 含有含有1313個碳原子，內(nèi)酯環(huán)的個碳原子，內(nèi)酯環(huán)的C-3C-3通過氧原通過氧原 子與紅霉糖相聯(lián)結(jié)，子與紅霉糖相聯(lián)結(jié)，C-5C-5通過氧原子與去通過氧原子與去 氧氨基己糖相連接。紅霉糖本身不含氮，氧氨基己糖相連接。紅霉糖本身不含氮， 是含有一個甲

9、氧基的己糖，去氧氨基己是含有一個甲氧基的己糖，去氧氨基己 糖是糖是3-3-二甲胺基去氧己糖。二甲胺基去氧己糖。 二、理化性質(zhì)二、理化性質(zhì) 紅霉素紅霉素A是白色結(jié)晶性粉末，微有吸濕性，味苦，是白色結(jié)晶性粉末，微有吸濕性，味苦， 易溶于醇類、丙酮、氯仿，微溶于乙醚。易溶于醇類、丙酮、氯仿，微溶于乙醚。 在水中的溶解度為在水中的溶解度為2mg/ml( (25C左右左右) )，它隨著，它隨著 溫度的升高而減少，溫度的升高而減少，55C時為最小。時為最小。 在室溫和在室溫和pH68的條件下，其溶液相當穩(wěn)定，的條件下，其溶液相當穩(wěn)定， 溫度升高穩(wěn)定性下降。溫度升高穩(wěn)定性下降。 紅霉素堿能和有機酸或無機酸類

10、結(jié)合成鹽，其鹽紅霉素堿能和有機酸或無機酸類結(jié)合成鹽，其鹽 類易溶于水。類易溶于水。 三、作用及應用范圍三、作用及應用范圍 紅霉素是紅霉素是廣譜廣譜抗生素，對革蘭陽性菌作用強，臨抗生素，對革蘭陽性菌作用強，臨 床上主要用于呼吸道感染、皮膚與軟組織感染、床上主要用于呼吸道感染、皮膚與軟組織感染、 泌尿生殖系統(tǒng)感染及胃腸道感染等。用于治療泌尿生殖系統(tǒng)感染及胃腸道感染等。用于治療腹腹 瀉瀉、菌痢菌痢、膽囊炎膽囊炎、瘧疾瘧疾、綠膿桿菌繼發(fā)感染、綠膿桿菌繼發(fā)感染、 支氣管炎、哮喘和膿毒性心內(nèi)膜炎皆有效。紅霉支氣管炎、哮喘和膿毒性心內(nèi)膜炎皆有效。紅霉 素的毒副作用少，主要副作用為素的毒副作用少，主要副作用為

11、惡心惡心和和嘔吐嘔吐等胃等胃 腸道反應，適用于青霉素過敏者。腸道反應，適用于青霉素過敏者。 第三節(jié)第三節(jié) 紅霉素的發(fā)酵工藝紅霉素的發(fā)酵工藝 紅霉素紅霉素是是19521952年于菲律賓群島找到的紅霉素鏈霉年于菲律賓群島找到的紅霉素鏈霉 菌菌( (Streptomyces erythreus) )所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物。所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物。 紅 霉 素 鏈 霉 菌 后 來 被 稱 作 紅 色 糖 多 孢 菌紅 霉 素 鏈 霉 菌 后 來 被 稱 作 紅 色 糖 多 孢 菌 （Saccharopolys erythrea) )。 目前仍然采用該菌的變株來生產(chǎn)紅霉素游離堿，目前仍然采用該菌的變株來生產(chǎn)紅霉素游

12、離堿， 再由其制成各種鹽類或酯類，如乳糖酸紅霉素、再由其制成各種鹽類或酯類，如乳糖酸紅霉素、 紅霉素硬脂酸酯、紅霉素碳酸乙酯和無味紅霉素紅霉素硬脂酸酯、紅霉素碳酸乙酯和無味紅霉素 等。等。 一、紅霉素的發(fā)酵工藝流程一、紅霉素的發(fā)酵工藝流程 二、產(chǎn)生菌的培養(yǎng)二、產(chǎn)生菌的培養(yǎng) 紅霉素鏈霉菌紅霉素鏈霉菌在合成瓊脂培養(yǎng)基上生長的在合成瓊脂培養(yǎng)基上生長的 菌落，是由淡黃色變?yōu)槲Ш值募t色，色菌落，是由淡黃色變?yōu)槲Ш值募t色，色 素不滲透到培養(yǎng)基中，氣生菌絲為白色，素不滲透到培養(yǎng)基中，氣生菌絲為白色， 孢子絲呈不緊密的孢子絲呈不緊密的螺旋狀螺旋狀，約，約3 35 5圈，孢圈，孢 子呈球狀。常用砂土管或冷凍

13、管保存，以子呈球狀。常用砂土管或冷凍管保存，以 冷凍管保存的孢子質(zhì)量好。冷凍管保存的孢子質(zhì)量好。 紅霉素鏈霉菌一般經(jīng)斜面孢子、搖瓶培養(yǎng)、種紅霉素鏈霉菌一般經(jīng)斜面孢子、搖瓶培養(yǎng)、種 子罐培養(yǎng)后移入發(fā)酵罐進行發(fā)酵生產(chǎn)。子罐培養(yǎng)后移入發(fā)酵罐進行發(fā)酵生產(chǎn)。 斜面孢子培養(yǎng)基組分斜面孢子培養(yǎng)基組分( () )：淀粉淀粉1.O1.O、硫酸銨硫酸銨 O.3O.3、氯化鈉氯化鈉O.3O.3、玉米漿玉米漿1.01.0、碳酸鈣碳酸鈣O.25O.25、瓊、瓊 脂脂2.22.2，pH7.OpH7.O7.27.2。 斜面孢子培養(yǎng)基消毒后必須重視冷卻時間的控斜面孢子培養(yǎng)基消毒后必須重視冷卻時間的控 制，以快速為妥，冷卻時間

14、過長對生長孢子不制，以快速為妥，冷卻時間過長對生長孢子不 利。利。 瓊脂的質(zhì)量對孢子質(zhì)量和數(shù)量也有重要影響。瓊脂的質(zhì)量對孢子質(zhì)量和數(shù)量也有重要影響。 斜面培養(yǎng)溫度斜面培養(yǎng)溫度3737，濕度，濕度5050左右，左右，避光避光培養(yǎng)。培養(yǎng)。 因為光會抑制孢子的形成。培養(yǎng)因為光會抑制孢子的形成。培養(yǎng)7 71010天斜面上天斜面上 長成白色至深米色孢子，色澤新鮮、均勻、無黑長成白色至深米色孢子，色澤新鮮、均勻、無黑 點，背面產(chǎn)生紅色或紅棕色色素。點，背面產(chǎn)生紅色或紅棕色色素。 每批孢子成熟后除做每批孢子成熟后除做搖瓶試驗搖瓶試驗測定生產(chǎn)能力外，測定生產(chǎn)能力外， 還應插進一還應插進一試驗罐試驗罐對比考察發(fā)

15、酵水平，如不低于對比考察發(fā)酵水平，如不低于 前批孢子，可用于生產(chǎn)。前批孢子，可用于生產(chǎn)。 搖瓶種子培養(yǎng)基搖瓶種子培養(yǎng)基( () )：淀粉：淀粉4.04.0、糊精、糊精2.02.0、蛋白、蛋白 胨胨5.05.0、葡萄糖、葡萄糖1.01.0、黃豆餅粉、黃豆餅粉1.51.5、硫酸銨、硫酸銨0.250.25、 氯化鈉氯化鈉0.40.4、硫酸鎂、硫酸鎂0.050.05、磷酸二氫鉀、磷酸二氫鉀0.020.02、碳酸、碳酸 鈣鈣0.60.6，pH7.0pH7.0。接種后于。接種后于28283535在搖床培養(yǎng)，在搖床培養(yǎng)， 待菌絲生長濃厚，接入發(fā)酵罐。待菌絲生長濃厚，接入發(fā)酵罐。 v紅霉素產(chǎn)生菌從孢子發(fā)芽到生

16、長繁殖菌絲的紅霉素產(chǎn)生菌從孢子發(fā)芽到生長繁殖菌絲的過程過程 較長較長，通過搖瓶培養(yǎng)，將菌絲接入種子罐，雖能，通過搖瓶培養(yǎng)，將菌絲接入種子罐，雖能 縮短種子罐培養(yǎng)時間，但操作步驟增多，易發(fā)生縮短種子罐培養(yǎng)時間，但操作步驟增多，易發(fā)生 染菌現(xiàn)象，大多數(shù)生產(chǎn)廠都采用將子瓶孢子制成染菌現(xiàn)象，大多數(shù)生產(chǎn)廠都采用將子瓶孢子制成 菌懸液菌懸液接入種子罐。接入種子罐。 種子罐培養(yǎng)基由種子罐培養(yǎng)基由花生餅粉花生餅粉、蛋白胨蛋白胨、硫酸銨硫酸銨及及 淀粉淀粉、葡萄糖葡萄糖等組成。一級種子罐的培養(yǎng)溫度為等組成。一級種子罐的培養(yǎng)溫度為 3535，培養(yǎng)時間，培養(yǎng)時間65h65h左右；二級種子罐培養(yǎng)溫度左右；二級種子罐培

17、養(yǎng)溫度 3333，培養(yǎng)時間，培養(yǎng)時間40h40h左右，通氣量均為左右，通氣量均為1.5 m3/(m3 h)。種子生長成熟，即可移入發(fā)酵罐。種子生長成熟，即可移入發(fā)酵罐。 接種量接種量為為1010。 三、發(fā)酵生產(chǎn)及控制要點三、發(fā)酵生產(chǎn)及控制要點 紅霉素發(fā)酵一般都使用紅霉素發(fā)酵一般都使用復合培養(yǎng)基復合培養(yǎng)基：淀：淀 粉、葡萄糖為碳源；黃豆餅粉、硫酸銨粉、葡萄糖為碳源；黃豆餅粉、硫酸銨 為氮源；以碳酸鈣作緩沖劑；為氮源；以碳酸鈣作緩沖劑；丙醇或丙丙醇或丙 酸酸作為作為前體前體。接種量為。接種量為1010，培養(yǎng)溫度，培養(yǎng)溫度 為為28283535，pHpH值為值為7.07.0。 (1) (1) 發(fā)酵培

18、養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)基 碳源碳源 最適碳源最適碳源蔗糖蔗糖，其次葡萄糖、淀粉、糊精。，其次葡萄糖、淀粉、糊精。 從紅霉素生物合成途徑來看，葡萄糖直接進入分從紅霉素生物合成途徑來看，葡萄糖直接進入分 子中，蔗糖需經(jīng)分解為葡萄糖、果糖后才能被利子中，蔗糖需經(jīng)分解為葡萄糖、果糖后才能被利 用，蔗糖比葡萄糖適合，用，蔗糖比葡萄糖適合，可能可能是蔗糖是蔗糖分解速率分解速率正正 適合菌體對糖利用速率，不會積累中間產(chǎn)物或使適合菌體對糖利用速率，不會積累中間產(chǎn)物或使 pHpH值下降。值下降。 8080葡萄糖和葡萄糖和2020淀粉淀粉混合，混合，效果與使用蔗糖相似效果與使用蔗糖相似 由于由于糖類糖類是用于構(gòu)成紅霉素分子

19、的碳原子，當是用于構(gòu)成紅霉素分子的碳原子，當 糖耗盡時，由于缺乏合成紅霉素的原料，合成糖耗盡時，由于缺乏合成紅霉素的原料，合成 就會停止，因此在發(fā)酵過程中通過就會停止，因此在發(fā)酵過程中通過補料形式補料形式進進 行控制。行控制。 有的突變株適合應用有的突變株適合應用6 6油作為唯一的碳源用于油作為唯一的碳源用于 發(fā)酵，不再需要加前體，發(fā)酵效價高達發(fā)酵，不再需要加前體，發(fā)酵效價高達10000 10000 U/mlU/ml。 氮源氮源 以黃豆餅粉為主，花生餅粉、玉米漿、硫酸銨。以黃豆餅粉為主，花生餅粉、玉米漿、硫酸銨。 長期常溫貯存黃豆餅粉，可能會產(chǎn)生一種對孢子發(fā)長期常溫貯存黃豆餅粉，可能會產(chǎn)生一種

20、對孢子發(fā) 芽和菌絲生長有害的毒素。黃豆餅粉消毒時泡沫較芽和菌絲生長有害的毒素。黃豆餅粉消毒時泡沫較 多，因此一、二級種子罐及后期補料可用部分花生多，因此一、二級種子罐及后期補料可用部分花生 餅粉代替。餅粉代替。 當培養(yǎng)液內(nèi)當培養(yǎng)液內(nèi)可溶性可溶性NH4+濃度下降耗盡，菌體量停止?jié)舛认陆岛谋M，菌體量停止 生長時，才開始合成紅霉素。生長時，才開始合成紅霉素。 試驗證明，發(fā)酵培養(yǎng)基中加入試驗證明，發(fā)酵培養(yǎng)基中加入Mg2(PO4)2和沸石和沸石 等等NH4+“捕捉劑捕捉劑”，可以提高大環(huán)內(nèi)酯類抗生，可以提高大環(huán)內(nèi)酯類抗生 素生產(chǎn)量。這些物質(zhì)和素生產(chǎn)量。這些物質(zhì)和NHNH4 4+ +結(jié)合，使之緩慢地釋結(jié)合

21、，使之緩慢地釋 放，而逐步為菌絲所利用合成抗生素。放，而逐步為菌絲所利用合成抗生素。 前體前體 丙醇丙醇( (或或丙酸丙酸、丙酸鈉丙酸鈉) )是紅霉內(nèi)酯的前體物質(zhì)，是紅霉內(nèi)酯的前體物質(zhì)， 可以明顯提高紅霉素可以明顯提高紅霉素A A的產(chǎn)量。但這些前體物質(zhì)的產(chǎn)量。但這些前體物質(zhì) 對菌絲生長有抑制作用。對菌絲生長有抑制作用。 以以丙醇丙醇作前體時，代謝較穩(wěn)定，對作前體時，代謝較穩(wěn)定，對pHpH值影響小，值影響小， 發(fā)酵單位及成品質(zhì)量都比較高。丙醇對菌絲生長發(fā)酵單位及成品質(zhì)量都比較高。丙醇對菌絲生長 抑制程度與其濃度相對應。當發(fā)酵液菌絲長濃，抑制程度與其濃度相對應。當發(fā)酵液菌絲長濃， pHpH值高于值

22、高于6.56.5時，可開始加前體，每隔時，可開始加前體，每隔24h24h補一次，補一次， 全程共補全程共補5 56 6次，總量約為次，總量約為1 1。 丙酸丙酸對菌絲的毒性作用大于丙醇，如用丙酸作前對菌絲的毒性作用大于丙醇，如用丙酸作前 體時，其加入量、加入速度控制不當易使菌絲自體時，其加入量、加入速度控制不當易使菌絲自 溶，影響正常發(fā)酵溶，影響正常發(fā)酵, ,甚至全罐損失，最好甚至全罐損失，最好加水稀釋加水稀釋 降低丙酸濃度，減慢加入速度或用降低丙酸濃度，減慢加入速度或用丙酸鈉丙酸鈉代替。代替。 (2) (2) 通氣和攪拌通氣和攪拌 發(fā)酵最初發(fā)酵最初12h12h，通氣比可保持在，通氣比可保持在

23、1:0.4vvm1:0.4vvm，12h12h 后至放罐可控制在后至放罐可控制在1:0.81:0.81.0vvm1.0vvm，所用攪拌的，所用攪拌的 輸入功率為輸入功率為1.51.52kW/1000L2kW/1000L培養(yǎng)基。增大空氣流培養(yǎng)基。增大空氣流 量和加快攪拌轉(zhuǎn)速會提高發(fā)酵單位，但必須加強量和加快攪拌轉(zhuǎn)速會提高發(fā)酵單位，但必須加強 補料的工藝控制，防止菌絲早衰自溶，否則會給補料的工藝控制，防止菌絲早衰自溶，否則會給 成品質(zhì)量帶來不良影響。成品質(zhì)量帶來不良影響。 菌體代謝過程產(chǎn)的菌體代謝過程產(chǎn)的CO2影響紅霉素的生物合成。影響紅霉素的生物合成。 如果自發(fā)酵如果自發(fā)酵15h15h后開始導入

24、后開始導入CO2( (按進氣量按進氣量1111) )， 直到發(fā)酵結(jié)束，紅霉素的合成量減少至直到發(fā)酵結(jié)束，紅霉素的合成量減少至4040，合，合 成率從成率從0.2U/(hml)降到降到0.07U/(hml)。但。但CO2分壓分壓 的增加并不影響菌體的生長。的增加并不影響菌體的生長。 CO2對紅霉素合成的抑制作用可能是由于對紅霉素合成的抑制作用可能是由于CO2與與 丙酸鹽反應形成的甲基丙二酸所產(chǎn)生的反饋抑制，丙酸鹽反應形成的甲基丙二酸所產(chǎn)生的反饋抑制， 使紅霉內(nèi)酯的合成受到抑制而降低發(fā)酵單位。使紅霉內(nèi)酯的合成受到抑制而降低發(fā)酵單位。 (3) (3) 溫度溫度 發(fā)酵全過程溫度控制在發(fā)酵全過程溫度控制

25、在3131，如發(fā)酵激烈有轉(zhuǎn)稀，如發(fā)酵激烈有轉(zhuǎn)稀 趨勢時，可適當降低培養(yǎng)溫度趨勢時，可適當降低培養(yǎng)溫度(28(2830)30)，以，以 延長衰老自溶時間，推遲轉(zhuǎn)稀時間。后期罐溫更延長衰老自溶時間，推遲轉(zhuǎn)稀時間。后期罐溫更 需控制，溫度偏高，會使菌絲在短時間內(nèi)迅速自需控制，溫度偏高，會使菌絲在短時間內(nèi)迅速自 溶，紅霉素溶，紅霉素C C比例增加，并影響過濾濾速。比例增加，并影響過濾濾速。 (4) pH(4) pH值值 整個發(fā)酵過程必須保持整個發(fā)酵過程必須保持pH6.6pH6.67.27.2，生物合成，生物合成 的最佳的最佳pHpH值為值為6.76.76.96.9，pHpH值低于值低于6.56.5對生

26、物合對生物合 成不利，成不利，pHpH值若高于值若高于7.27.2菌絲易自溶，且會導致菌絲易自溶，且會導致 紅霉素紅霉素C C的比價增加，紅霉素的比價增加，紅霉素A A的含量相應降低，的含量相應降低， 影響成品質(zhì)量。影響成品質(zhì)量。 (5) (5) 中間補料中間補料 還原糖還原糖控制在控制在1.01.01.41.4，當還原糖，當還原糖1 1，每，每 隔隔6h6h加入葡萄糖液加入葡萄糖液(40(405050) )一次，直至放罐前一次，直至放罐前 121218h18h停止加糖。停止加糖。 發(fā)酵約發(fā)酵約40h40h后每隔后每隔24h24h補一次花生餅粉、硫酸銨、酵補一次花生餅粉、硫酸銨、酵 母粉母粉0

27、.010.010.050.05，可防止發(fā)酵液變稀，增多泡，可防止發(fā)酵液變稀，增多泡 沫而影響過濾速率。沫而影響過濾速率。 后期通氨后期通氨( (滴加氨水滴加氨水) )，對提高發(fā)酵單位、改善成品，對提高發(fā)酵單位、改善成品 質(zhì)量均有好處。發(fā)酵過程中如果發(fā)酵液質(zhì)量均有好處。發(fā)酵過程中如果發(fā)酵液粘度粘度過高，過高， 可適當補加可適當補加無菌水無菌水進行稀釋。進行稀釋。 (6) 泡沫與消泡泡沫與消泡 發(fā)酵培養(yǎng)基有黃豆餅粉，在培養(yǎng)基消毒及通空氣發(fā)酵培養(yǎng)基有黃豆餅粉，在培養(yǎng)基消毒及通空氣 時泡沫較多。一般以時泡沫較多。一般以植物油植物油( (豆油或菜籽油豆油或菜籽油) )作消作消 泡劑，不宜一次多量加入，尤

28、其是后期，不僅會泡劑，不宜一次多量加入，尤其是后期，不僅會 促使菌絲自溶，還會給提煉帶來困難。促使菌絲自溶，還會給提煉帶來困難。 有些生產(chǎn)在接種后采取不開攪拌的措施，逐步將有些生產(chǎn)在接種后采取不開攪拌的措施，逐步將 通氣量增大，等到菌絲長濃后，再開攪拌，以減通氣量增大，等到菌絲長濃后，再開攪拌，以減 少消泡劑的用量。少消泡劑的用量。 第四節(jié)第四節(jié) 紅霉素的提取和精制紅霉素的提取和精制 一、發(fā)酵液的預處理和過濾一、發(fā)酵液的預處理和過濾 發(fā)酵液含有約發(fā)酵液含有約0.80.8紅霉素，絕大部分是紅霉素，絕大部分是菌絲體菌絲體、 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)、色素色素、油油等雜質(zhì)，給提取和精制帶來困等雜質(zhì)，給提取和精制

29、帶來困 難。尤其蛋白質(zhì)和油，溶劑萃取時產(chǎn)生嚴重乳化難。尤其蛋白質(zhì)和油，溶劑萃取時產(chǎn)生嚴重乳化 現(xiàn)象，使含有紅霉素的溶劑夾雜在水相中而被廢現(xiàn)象，使含有紅霉素的溶劑夾雜在水相中而被廢 棄，影響收率。棄，影響收率。 一般采用一般采用硫酸鋅硫酸鋅沉淀蛋白質(zhì)，促使菌絲結(jié)團加快沉淀蛋白質(zhì)，促使菌絲結(jié)團加快 濾速。濾速。 由于硫酸鋅呈酸性，為了防止紅霉素局部酸解而由于硫酸鋅呈酸性，為了防止紅霉素局部酸解而 破壞，要用破壞，要用NaOHNaOH調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)pHpH值。值。 加入加入去乳化劑去乳化劑十二烷基苯磺酸鈉；它是酸性物質(zhì)，十二烷基苯磺酸鈉；它是酸性物質(zhì)， 在堿性條件下留在水相，可減輕或避免乳化現(xiàn)象。在堿性條

30、件下留在水相，可減輕或避免乳化現(xiàn)象。 在發(fā)酵液中加入蛋白酶和酯酶在發(fā)酵液中加入蛋白酶和酯酶( (無花果酶、菠蘿無花果酶、菠蘿 酶等酶等) )，4545、pH6.0pH6.07.57.5，1h1h。處理后的發(fā)酵。處理后的發(fā)酵 原液的效價由原液的效價由2885U/ml2885U/ml上升到上升到3000U/ml3000U/ml，經(jīng)乙酸，經(jīng)乙酸 丁酯丁酯( (戊酯戊酯) )萃取還增加了提取收率。萃取還增加了提取收率。 二、紅霉素的提取二、紅霉素的提取 v紅霉素分子結(jié)構(gòu)中有一個紅霉素分子結(jié)構(gòu)中有一個二甲基氨基二甲基氨基官能團，是官能團，是 一個一個弱堿弱堿，在，在酸性條件酸性條件下與某些下與某些酸酸會

31、形成鹽，如會形成鹽，如 紅霉素乳酸鹽。純紅霉素堿在水中溶解度較小，紅霉素乳酸鹽。純紅霉素堿在水中溶解度較小， 并隨溫度升高而減小，在并隨溫度升高而減小，在5555時溶解度最??；時溶解度最?。?v當當pHpH6.06.0時，紅霉素以時，紅霉素以鹽鹽的形式存在，其在水中的形式存在，其在水中 的溶解度隨的溶解度隨pHpH值降低而迅速增大；當值降低而迅速增大；當pH10.0pH10.0時紅時紅 霉素基本以霉素基本以游離堿游離堿的形式存在，能溶于的形式存在，能溶于醋酸丁酯醋酸丁酯 中，因此，采用在水溶液中，因此，采用在水溶液( (乙酸緩沖液乙酸緩沖液) )及在乙酸及在乙酸 丁酯中反復萃取，可以達到丁酯中

32、反復萃取，可以達到濃縮濃縮和和提純提純的目的。的目的。 溶劑法提取和精制紅霉素的工藝流程溶劑法提取和精制紅霉素的工藝流程 溶劑萃取工藝的控制要點溶劑萃取工藝的控制要點 (1) (1) pHpH值值 v發(fā)酵液預處理時需用發(fā)酵液預處理時需用NaOHNaOH將將pHpH值調(diào)至值調(diào)至7.87.88.28.2，同，同 時控制加料速度并開攪拌，防止局部過堿。時控制加料速度并開攪拌，防止局部過堿。 v堿化時堿化時pHpH值高些，對提取有利，但不能過高，否則值高些，對提取有利，但不能過高，否則 會引起紅霉素的堿性破壞，同時堿性高對乳濁液的會引起紅霉素的堿性破壞，同時堿性高對乳濁液的 穩(wěn)定性有利，使乳化嚴重。穩(wěn)

33、定性有利，使乳化嚴重。pHpH值過低，對萃取也不值過低，對萃取也不 利，影響收率。堿化時利，影響收率。堿化時pHpH值控制在值控制在9 91010范圍較適范圍較適 宜。酸化時控制宜。酸化時控制pHpH值在值在4.04.05.05.0范圍范圍。 (2) 溫度溫度 由于紅霉素在水中的溶解度以由于紅霉素在水中的溶解度以5555時為最小，因時為最小，因 此，當紅霉素從水相轉(zhuǎn)入溶劑時可適當加溫至此，當紅霉素從水相轉(zhuǎn)入溶劑時可適當加溫至 30303232。從緩沖液轉(zhuǎn)入第二次丁酯時，一般也。從緩沖液轉(zhuǎn)入第二次丁酯時，一般也 加熱到加熱到38384040。加溫的目的在于減少紅霉素在。加溫的目的在于減少紅霉素在

34、 水相中的溶解度，有利于萃取。水相中的溶解度，有利于萃取。 萃取液最后在萃取液最后在-5-5、1010丙酮水溶液中丙酮水溶液中結(jié)晶結(jié)晶。真。真 空干燥，控制干燥溫度在空干燥，控制干燥溫度在70708080。 紅霉素是堿性化合物，中性和酸性條件下呈紅霉素是堿性化合物，中性和酸性條件下呈陽離陽離 子子，可用，可用離子交換法離子交換法來提取。來提取。 可采用交聯(lián)度約為可采用交聯(lián)度約為1 15.55.5的多孔性的多孔性陽離子交陽離子交 換樹脂換樹脂，在，在pH5.5pH5.57.0 (pH5.57.0 (pH5.5，紅霉素十分不，紅霉素十分不 穩(wěn)定穩(wěn)定) )條件下進行條件下進行吸附吸附，用水、，用水、

35、3 3及及6060甲醇液甲醇液 洗滌洗滌，有效地除去有色雜質(zhì)，再用，有效地除去有色雜質(zhì)，再用堿性醇堿性醇溶液溶液 (0.25mol/L(0.25mol/L氨的氨的9090甲醇溶液甲醇溶液) )洗脫樹脂上的紅霉洗脫樹脂上的紅霉 素，洗脫液于素，洗脫液于5050進行真空蒸發(fā)，得濃縮萃取液。進行真空蒸發(fā)，得濃縮萃取液。 總收率按發(fā)酵濾液計可達總收率按發(fā)酵濾液計可達7070。 第五節(jié)第五節(jié) 大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的生產(chǎn)現(xiàn)狀大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的生產(chǎn)現(xiàn)狀 及研究進展及研究進展 1 1、大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的發(fā)展概況、大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的發(fā)展概況 l紅霉素兩個致命紅霉素兩個致命弱點弱點： 口服時易為胃酸降解；口服時易為胃

36、酸降解； 對其耐藥性致病菌逐年增多。對其耐藥性致病菌逐年增多。 l對其結(jié)構(gòu)進行改造。對紅霉素大環(huán)對其結(jié)構(gòu)進行改造。對紅霉素大環(huán)C-6C-6位羥基進行甲基化、位羥基進行甲基化、 對大環(huán)結(jié)構(gòu)進行肟化等形成了當前臨床上廣泛使用的第二對大環(huán)結(jié)構(gòu)進行肟化等形成了當前臨床上廣泛使用的第二 代紅霉素，如阿奇霉素、克拉霉素等。第二代紅霉素雖然代紅霉素，如阿奇霉素、克拉霉素等。第二代紅霉素雖然 能夠克服能夠克服胃酸胃酸對紅霉素的降解，但仍不能解決對紅霉素的降解，但仍不能解決細菌耐藥性細菌耐藥性 問題。問題。 v現(xiàn)在正在研制第三代紅霉素現(xiàn)在正在研制第三代紅霉素- -酮內(nèi)酯酮內(nèi)酯類抗生素，不類抗生素，不 僅可以增強

37、紅霉素的酸穩(wěn)定性，而且對許多耐藥僅可以增強紅霉素的酸穩(wěn)定性，而且對許多耐藥 性細菌也具有殺死或抑制作用。被認為是下一代性細菌也具有殺死或抑制作用。被認為是下一代 治療耐藥性細菌的抗生素。治療耐藥性細菌的抗生素。 v上世紀上世紀9090年代，年代，H.M.R 公司通過水解除去紅霉素公司通過水解除去紅霉素 結(jié)構(gòu)上的結(jié)構(gòu)上的C-3C-3克拉定糖，并氧化羥基為羰基，得到克拉定糖，并氧化羥基為羰基，得到 一類新型結(jié)構(gòu)的抗生素，命名一類新型結(jié)構(gòu)的抗生素，命名酮內(nèi)酯酮內(nèi)酯( (Ketolide) )。 由于改變了與細菌核蛋白體亞基的結(jié)合位點，從由于改變了與細菌核蛋白體亞基的結(jié)合位點，從 而克服了細菌抗藥性。

38、泰利霉素、而克服了細菌抗藥性。泰利霉素、ABT-773 v在對紅霉素結(jié)構(gòu)進行化學改造的同時，也在積極在對紅霉素結(jié)構(gòu)進行化學改造的同時，也在積極 探索通過基因工程途徑對紅霉素的結(jié)構(gòu)進行改造，探索通過基因工程途徑對紅霉素的結(jié)構(gòu)進行改造， 以期獲得抗酸和對耐藥性細菌具有活性的新的紅以期獲得抗酸和對耐藥性細菌具有活性的新的紅 霉素類抗生素藥物。霉素類抗生素藥物。 v紅霉素的基因工程改造是建立在對紅霉素紅霉素的基因工程改造是建立在對紅霉素生物合生物合 成成分子生物學認識基礎上的。紅霉素的生物合成分子生物學認識基礎上的。紅霉素的生物合成 可分為兩部分：大環(huán)內(nèi)酯環(huán)的合成和大環(huán)內(nèi)酯環(huán)可分為兩部分：大環(huán)內(nèi)酯環(huán)的合成和大環(huán)內(nèi)酯環(huán) 的后修飾。的后修飾。 v基因工程不僅可以改造紅霉素內(nèi)酯環(huán)基因工程