臨床免疫學(xué)檢驗：第5章 凝集反應(yīng)和沉淀反應(yīng)

1、第五章 凝集反應(yīng)和沉淀反應(yīng)(Chapter 5 Agglutination And Precipitation Reaction)臨床免疫學(xué)檢驗主 要 內(nèi) 容第一節(jié) 凝集反應(yīng)1第二節(jié) 沉淀反應(yīng)2第三節(jié) 凝集反應(yīng)和沉淀反應(yīng)的應(yīng)用3目錄(Section 1 Agglutination Reaction) 凝集反應(yīng)是指細菌和紅細胞等顆粒性抗原或表面包被可溶性抗原（或抗體）與相應(yīng)抗體（或抗原）特異性結(jié)合后，一定條件下，形成肉眼可見的凝集現(xiàn)象。第一節(jié) 凝集反應(yīng)第一節(jié) 凝集反應(yīng)一、直接凝集反應(yīng) 在適當電解質(zhì)參與下，細菌、螺旋體和紅細胞等顆粒性抗原直接與相應(yīng)抗體結(jié)合出現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象。第一節(jié) 凝集反應(yīng)一

2、、直接凝集反應(yīng)（一）玻片凝集試驗第一節(jié) 凝集反應(yīng)一、直接凝集反應(yīng)（二）試管凝集試驗第一節(jié) 凝集反應(yīng)二、間接凝集反應(yīng) 將可溶性抗原（或抗體）先吸附于適當大小的顆粒性載體（如正常人O型紅細胞、細菌、膠乳顆粒等）的表面，然后與相應(yīng)抗體（或抗原）作用，在適宜的電解質(zhì)存在條件下，出現(xiàn)特異性凝集現(xiàn)象。第一節(jié) 凝集反應(yīng)二、間接凝集反應(yīng)（一）正向間接凝集反應(yīng) 用可溶性抗原致敏載體以檢測標本中的待檢抗體。第一節(jié) 凝集反應(yīng)二、間接凝集反應(yīng)（二）反向間接凝集反應(yīng) 用特異性抗體致敏載體以檢測標本中的待檢抗原。第一節(jié) 凝集反應(yīng)二、間接凝集反應(yīng)（三）間接凝集抑制反應(yīng) 用抗原致敏的顆粒載體及相應(yīng)的抗體作為診斷試劑，檢測標本

3、中是否存在與致敏抗原相同的抗原。第一節(jié) 凝集反應(yīng)二、間接凝集反應(yīng)（四）協(xié)同凝集反應(yīng) 以葡萄球菌蛋白A（SPA）做載體的反向間接凝集反應(yīng)。用于細菌、病毒的直接檢測。第一節(jié) 凝集反應(yīng)三、間接血凝試驗 以紅細胞作為載體的間接凝集試驗。第一節(jié) 凝集反應(yīng)三、間接血凝試驗自身紅細胞凝集試驗可用于抗HIV抗體、HBsAg的檢測。第一節(jié) 凝集反應(yīng)四、膠乳凝集試驗以聚苯乙烯膠乳為載體的間接凝集試驗。第一節(jié) 凝集反應(yīng)五、明膠凝集試驗 以粉紅色明膠吸附病毒抗原或重組抗原，再與待檢血清作用，出現(xiàn)肉眼可見的粉紅色凝集。常用于抗HIV-1抗體和抗精子抗體檢測等。第一節(jié) 凝集反應(yīng)六、抗球蛋白試驗 是抗球蛋白參與的間接血凝試

4、驗，用于檢測抗紅細胞不完全抗體。又稱為Coombs試驗。直接Coombs試驗間接Coombs試驗第一節(jié) 凝集反應(yīng)六、抗球蛋白試驗（一）直接Coombs試驗 常用于檢測新生兒溶血癥、自身免疫性溶血癥、特發(fā)性自身免疫性貧血和醫(yī)源性溶血等疾病的患者紅細胞上不完全抗體。第一節(jié) 凝集反應(yīng)六、抗球蛋白試驗（二）間接Coombs試驗 常用于檢測母體Rh（D）抗體和因紅細胞不相容的輸血所產(chǎn)生的血型抗體。第一節(jié) 凝集反應(yīng)特點：1可定性或半定量檢測；2方法簡便快速，敏感度高。第二節(jié) 沉淀反應(yīng)(Section 2 Precipitation Reaction) 沉淀反應(yīng)是指可溶性抗原與相應(yīng)抗體(多克隆抗體)在適當條

5、件下發(fā)生特異性結(jié)合而出現(xiàn)可見的沉淀現(xiàn)象。 反應(yīng)分兩個階段：特異性結(jié)合階段和可見階段。后者受抗原抗體比例、分子大小、親合力、絕對濃度、電解質(zhì)濃度和反應(yīng)溫度的影響。第二節(jié) 沉淀反應(yīng)一、液體內(nèi)沉淀試驗（一）環(huán)狀沉淀反應(yīng) 將已知抗血清和待測抗原反應(yīng)，在液面交界處特異結(jié)合形成白色環(huán)狀沉淀。操作簡單定性靈敏度低分辨率低第二節(jié) 沉淀反應(yīng)一、液體內(nèi)沉淀試驗（二）絮狀沉淀反應(yīng) 是抗原與相應(yīng)抗體特異結(jié)合，在電解質(zhì)存在的條件下，形成肉眼可見的絮狀沉淀物。 受抗原抗體比例的影響非常明顯，常用作測定抗原抗體的最適比例。有抗原稀釋法、抗體稀釋法和方正滴定法。第二節(jié) 沉淀反應(yīng)一、液體內(nèi)沉淀試驗（三）免疫濁度測定 是應(yīng)用抗原

6、抗體結(jié)合在液體中形成的IC干擾光線可用儀器檢測的特點，將現(xiàn)代光學(xué)測量儀器與自動分析檢測系統(tǒng)相結(jié)合應(yīng)用于沉淀反應(yīng)，對各種液體介質(zhì)中的微量物質(zhì)進行定量測定。第二節(jié) 沉淀反應(yīng)一、液體內(nèi)沉淀試驗（三）免疫濁度測定穩(wěn)定性高精確度高簡便快速易于自動化無放射性核素污染第二節(jié) 沉淀反應(yīng)一、液體內(nèi)沉淀試驗（三）免疫濁度測定1影響因素（1）抗原抗體的比例海德堡曲線理論第二節(jié) 沉淀反應(yīng)一、液體內(nèi)沉淀試驗（三）免疫濁度測定1影響因素（2）抗體的質(zhì)量特異性強效價高親合力強使用R型抗體第二節(jié) 沉淀反應(yīng)一、液體內(nèi)沉淀試驗（三）免疫濁度測定1影響因素（3）抗原抗體反應(yīng)的環(huán)境最適PH為6.58.5離子強度大，常用磷酸鹽緩沖液作

7、為反應(yīng)液第二節(jié) 沉淀反應(yīng)一、液體內(nèi)沉淀試驗（三）免疫濁度測定1影響因素（4）增濁劑使用聚乙二醇（PEG）、吐溫-20促進IC形成第二節(jié) 沉淀反應(yīng)一、液體內(nèi)沉淀試驗（三）免疫濁度測定2分類（1）根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的時間和反應(yīng)結(jié)合的動力學(xué)：速率比濁法終點比濁法第二節(jié) 沉淀反應(yīng)一、液體內(nèi)沉淀試驗（三）免疫濁度測定2分類（2）根據(jù)檢測儀器的位置及光信號性質(zhì)：透射免疫比濁法散射免疫比濁法第二節(jié) 沉淀反應(yīng)一、液體內(nèi)沉淀試驗（三）免疫濁度測定2分類（3）免疫膠乳比濁法：以膠乳作為載體對小分子復(fù)合物進行微量測定，提高了免疫濁度測定的靈敏度。第二節(jié) 沉淀反應(yīng)二、凝膠內(nèi)沉淀試驗（三）免疫濁度測定 是利用可溶性抗原和

8、相應(yīng)抗體在凝膠內(nèi)擴散，形成濃度梯度，在抗原抗體相遇并且濃度比例適當?shù)奈恢眯纬扇庋劭梢姷某恋砭€或沉淀環(huán)。常用凝膠包括：瓊脂、瓊脂糖、聚丙烯酰胺凝膠等。第二節(jié) 沉淀反應(yīng)二、凝膠內(nèi)沉淀試驗（一）單向免疫擴散試驗先將一定量的抗體混于瓊脂凝膠中，使待測的抗原溶液在瓊脂內(nèi)由局部向周圍自由擴散，在一定區(qū)域內(nèi)形成可見的沉淀環(huán)。第二節(jié) 沉淀反應(yīng)二、凝膠內(nèi)沉淀試驗（一）單向免疫擴散試驗第二節(jié) 沉淀反應(yīng)二、凝膠內(nèi)沉淀試驗（一）單向免疫擴散試驗常用于IgG、IgA、IgM、C3、C4等血漿蛋白的測定。定量測定（每次測定須制作標準曲線）重復(fù)性好靈敏度稍差（不能測定ug/ml以下含量）第二節(jié) 沉淀反應(yīng)二、凝膠內(nèi)沉淀試驗（

9、二）雙向免疫擴散試驗 將抗原和抗體加在同一瓊脂板對應(yīng)孔中，各自向?qū)Ψ綌U散，在濃度比例適當處形成沉淀線。第二節(jié) 沉淀反應(yīng)二、凝膠內(nèi)沉淀試驗（二）雙向免疫擴散試驗判斷抗原或抗體的存在以及評估相對含量分析抗原或抗體相對分子量分析抗原的性質(zhì)抗體效價的滴定鑒定抗原或抗體純度第二節(jié) 沉淀反應(yīng)二、凝膠內(nèi)沉淀試驗（二）雙向免疫擴散試驗定性測定靈敏度低出現(xiàn)結(jié)果慢第二節(jié) 沉淀反應(yīng)三、免疫電泳技術(shù) 是直流電場作用下的凝膠擴散試驗，是將抗原抗體反應(yīng)的高度特異性與電泳技術(shù)的高分辨率及快速、微量等特性相結(jié)合的免疫化學(xué)技術(shù)。加快沉淀反應(yīng)的速度；抗原抗體移動方向固定集中，提高了靈敏度。第二節(jié) 沉淀反應(yīng)三、免疫電泳技術(shù)（一）對

10、流免疫電泳 是將雙向免疫擴散與電泳相結(jié)合在直流電場中的定向加速的免疫擴散技術(shù)。第二節(jié) 沉淀反應(yīng)三、免疫電泳技術(shù)（一）對流免疫電泳第二節(jié) 沉淀反應(yīng)三、免疫電泳技術(shù)（一）對流免疫電泳簡便、快速；靈敏度比雙擴高816倍；定性檢測；常用于抗原或抗體的性質(zhì)、效價和純度測定。第二節(jié) 沉淀反應(yīng)三、免疫電泳技術(shù)（二）火箭免疫電泳 是單向免疫擴散與電泳相結(jié)合的一項定向加速的單向擴散試驗。第二節(jié) 沉淀反應(yīng)三、免疫電泳技術(shù)（二）火箭免疫電泳簡便、快速；可通過繪制標準曲線，定性檢測；靈敏度不高（ug/ml）；可利用免疫自顯影技術(shù)，提高靈敏度（ng/ml）；常用于IgG、IgA等蛋白定量。第二節(jié) 沉淀反應(yīng)三、免疫電泳技

11、術(shù)（三）免疫電泳 是先將蛋白質(zhì)抗原在凝膠中作區(qū)帶電泳，根據(jù)其所帶電荷、分子量和構(gòu)型不同分成不可見的若干區(qū)帶，然后沿電泳方向挖一與之平行的抗體槽，加入相應(yīng)抗血清，進行雙向擴散，兩者比例適合處形成弧形沉淀線。通過對沉淀線的數(shù)量、位置和形態(tài)與已知標準抗原抗體生成的沉淀線比較，可對待測樣品中所含成分的種類和性質(zhì)進行分析。第二節(jié) 沉淀反應(yīng)三、免疫電泳技術(shù)（三）免疫電泳第二節(jié) 沉淀反應(yīng)三、免疫電泳技術(shù)（四）免疫固定電泳 先將血清蛋白質(zhì)在瓊脂糖凝膠介質(zhì)上經(jīng)區(qū)帶電泳分離，再將固定劑和各型Ig及輕鏈抗血清加于凝膠表面的泳道上，經(jīng)孵育，固定劑和抗血清在凝膠內(nèi)滲透并擴散，抗原抗體直接發(fā)生沉淀反應(yīng)，洗脫游離的抗體，形成IC則保留在凝膠中。經(jīng)氨基黑，參考泳道和抗原抗體沉淀區(qū)帶被染色，根據(jù)電泳移動距離分離單克隆組分，可對各類Ig及其輕鏈進行分型。第二節(jié) 沉淀反應(yīng)三、免疫電泳技術(shù)（四）免疫固定電泳第二節(jié) 沉淀反應(yīng)三、免疫電泳技術(shù)（四）免疫固定電泳分辨率高，敏感度高；操作周期短；結(jié)果易分析；常用于鑒定遷移率相近的蛋白和M蛋白、Ig輕鏈，尿液、腦脊液等微量蛋白，游離輕鏈，補體裂解產(chǎn)物等。第二節(jié) 沉淀反應(yīng)三、免疫電泳技術(shù)（五）交叉免疫電泳 是區(qū)帶電泳與火箭免疫電泳結(jié)合的一項