心肌細(xì)胞生長、死亡與再生

心肌細(xì)胞生長、死亡與再生一般概念終末分化：rat3－4dhuman5m肥大：

退出細(xì)胞周期后，以肥大代替增殖；心臟負(fù)荷增加，以肥大代償；心肌細(xì)胞死亡，以瘢痕修復(fù)，以肥大代償。病理刺激心肌受損心肌肥大心力衰竭治療：去除病因，減少負(fù)荷，逆轉(zhuǎn)肥大心肌細(xì)胞是否有再生能力19世紀(jì)末－20世紀(jì)初：具有增殖能力1921－1925年：不具備增殖能力1.終末分化2.缺乏干細(xì)胞3.心肌壞死，以瘢痕修復(fù)4.少量增殖：是偶然，非主流問題心肌細(xì)胞的壽命＝人的壽命？正常心肌細(xì)胞不存在死亡？肥大心?。杭?xì)胞肥大》細(xì)胞壞死？對心肌細(xì)胞死亡的觀察現(xiàn)代標(biāo)記手段：正常心肌細(xì)胞存在死亡，如果沒有再生，幾十年內(nèi)心臟將丟失大部分心衰者心肌細(xì)胞死亡，如果沒有再生，心臟在幾個月或幾年內(nèi)會消失死亡再生死亡方式：凋亡，壞死，兩者均有正常、缺血：以凋亡為主；梗死區(qū)：以壞死為主，周邊以凋亡為主對心肌細(xì)胞增殖的觀察1960S,德國LINZBACH嚴(yán)重心功能障礙伴隨肥大和增生幾年后，RUMYANTSEV細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期1990S。PCNA,Ki67,Brdu等與增殖相關(guān)的抗原、標(biāo)記物的檢出，證明心肌細(xì)胞存在有絲分裂。1994Quaini:心衰末期，有絲分裂指數(shù)11/106；PCNA49%KAJSTWRA:CONFOCUS分裂指數(shù)對照組：14/106缺血性心臟病:152/106先天性心臟病:131/106

對心肌細(xì)胞增殖的觀察2001BELTRAMI:13例心肌梗塞細(xì)胞分裂相關(guān)核抗原Ki-67檢測－近梗塞區(qū)4％心肌細(xì)胞檢出，為對照84倍遠(yuǎn)離梗塞區(qū)1％心肌細(xì)胞檢出，為對照24倍有絲分裂指數(shù)－近梗塞區(qū)0.08％心肌細(xì)胞檢出，為對照70倍遠(yuǎn)離梗塞區(qū)0.03％心肌細(xì)胞檢出，為對照24倍

對心肌細(xì)胞增殖的觀察1999，F(xiàn)ELIX：成年心肌細(xì)胞＋出于S期新生鼠（2D）核與細(xì)胞質(zhì)提取物—70％進(jìn)入細(xì)胞周期2002QUAINI正常心肌細(xì)胞中存在原始細(xì)胞，可分裂增殖對心肌細(xì)胞增殖的觀察壓力負(fù)荷血流動力學(xué)改變是細(xì)胞生長的重要因素當(dāng)心功能處于代償期、無心衰－以肥大為主當(dāng)心功能下降、心衰—出現(xiàn)增殖正常細(xì)胞壽命心肌細(xì)胞體積：大細(xì)胞－老小細(xì)胞－年輕4M大鼠4000－11000um3

>9000um3，P161nk4a（抑制細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期）表達(dá)增多，凋亡增多。小細(xì)胞P161nk4a表達(dá)少，DNA復(fù)制活躍。在正常、病理情況下，死亡再生增殖細(xì)胞來源：KAJSTWRA實(shí)驗(yàn)室：把女性心臟移植到男性體內(nèi)，心肌細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)Y染色體。骨髓來源的干細(xì)胞

肝臟來源的干細(xì)胞血管來源的干細(xì)胞骨骼肌來源的干細(xì)胞心肌干細(xì)胞多潛能、未分化，在一定條件下可重建組織器官（組織工程）；損傷是分化的動力，如缺血壞死等輸入BMC：分化為心肌、血管內(nèi)皮、血管平滑肌干細(xì)胞動員劑：改變心梗功能，細(xì)胞增殖，新生細(xì)胞15/106，動脈毛細(xì)血管生成。BMC體外定向誘導(dǎo)：有搏動的心肌骨髓來源的干細(xì)胞(BMC)

骨髓來源的干細(xì)胞(BMC)骨髓間質(zhì)干細(xì)胞骨髓單個核細(xì)胞骨髓造血干細(xì)胞骨髓成血管細(xì)胞骨髓間質(zhì)干細(xì)胞

具有多分化潛能,可分化為骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞與肌肉細(xì)胞等。人和動物的骨髓間質(zhì)干細(xì)胞在體外經(jīng)定向誘導(dǎo)后可分化為心肌細(xì)胞、骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等。將純化的骨髓間質(zhì)干細(xì)胞注入到結(jié)扎左冠狀動脈的小鼠升主動脈內(nèi),發(fā)現(xiàn)骨髓間質(zhì)干細(xì)胞可經(jīng)冠脈循環(huán)到達(dá)心臟的缺血損傷病灶內(nèi),形成新生的心肌細(xì)胞或成纖維細(xì)胞。骨髓單個核細(xì)胞骨髓單個核細(xì)胞是指骨髓中細(xì)胞核形態(tài)為單個核細(xì)胞的總稱,包括造血干細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞前體細(xì)胞等。注入豬的心肌梗死灶中,可顯著提高射血分?jǐn)?shù),增加局部血流,增加梗死灶側(cè)枝循環(huán)將骨髓造血干細(xì)胞植入急性心肌梗死患者病灶內(nèi),可縮小梗死面積,增加射血分?jǐn)?shù)、心臟指數(shù),以及降低運(yùn)動時舒張末容積等。骨髓造血干細(xì)胞ＳＰ細(xì)胞(sidepopulationcell)是骨髓造血干細(xì)胞中存在一種亞單位,表達(dá)ＣＤ34-,具有多分化潛能。移植的ＳＰ細(xì)胞可經(jīng)體循環(huán)系統(tǒng)遷移到心肌受損傷的病灶內(nèi),形成新生血管及心肌細(xì)胞。從表達(dá)綠熒光增強(qiáng)蛋白(ＥＧＦＰ9)基因的裸鼠體內(nèi)提取一種特異表達(dá)Lin-ckitpos基因的骨髓造血干細(xì)胞,將其直接注入到裸鼠心臟的心肌梗死病灶周圍,可明顯改善心功能指標(biāo)，并在梗死病灶周圍形成相當(dāng)于病灶68%大小的新生組織,其中包含新生血管樣結(jié)構(gòu)及心肌細(xì)胞。骨髓成血管細(xì)胞存在于骨髓中的一種成血管細(xì)胞,表達(dá)ＣＤ34+,是血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞.將其從靜脈注射到裸鼠心梗動物模型體內(nèi),2天后,可遷移至梗死灶內(nèi),誘導(dǎo)病灶內(nèi)的微血管發(fā)生增殖與再生,抑制病灶周圍的心肌細(xì)胞凋亡,抑制心肌重構(gòu),減少瘢痕的形成,并顯著改善心功能。肝臟來源的干細(xì)胞來源于肝臟的干細(xì)胞亦可在體內(nèi)被誘導(dǎo)成心肌細(xì)胞。將來源于鼠肝的干細(xì)胞直接注射到裸鼠的左心室壁內(nèi),可在左心室壁內(nèi)形成新生的心肌細(xì)胞,而且,與內(nèi)源的心肌細(xì)胞結(jié)合完整,形成縫隙連接和閏盤。血管來源的干細(xì)胞從胚胎鼠的主動脈內(nèi)提取血管內(nèi)皮細(xì)胞,將其與鼠心肌細(xì)胞在體外共同培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞;將其注射到鼠的心臟內(nèi),也被誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞;將人的臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞,在上述類似的環(huán)境中培養(yǎng),也可分化為心肌細(xì)胞。骨骼肌來源的干細(xì)胞骨骼肌中的成肌細(xì)胞,又稱衛(wèi)星細(xì)胞,也具有干細(xì)胞的功能,可分化形成新的骨骼肌細(xì)胞。將成肌細(xì)胞移植到受損的心臟內(nèi),可分化為肌樣細(xì)胞,但形態(tài)上與心肌細(xì)胞有差異。有研究報道,將骨骼肌成肌細(xì)胞移植到人的心臟內(nèi),可改善心臟功能。心肌干細(xì)胞OhH6－12周齡的C57BL/6小鼠心臟，Sca-1+,

lin–,CD45–,CD31+CD38+細(xì)胞：缺乏血細(xì)胞系、骨髓造血干細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞、成熟內(nèi)皮細(xì)胞表型可表達(dá)一系列心肌轉(zhuǎn)錄基因（GATA-4，MEF-2C，TEF-1），但不表達(dá)心肌結(jié)構(gòu)基因（-MHC，-MHC，MLC-2a，MLC-2v，c&sk

-actin等）在體外分化成心肌細(xì)胞，將其注入心肌梗死區(qū)后也能在體內(nèi)分化成心肌細(xì)胞，改善心臟功能。

新生心肌細(xì)胞檢測方法心肌細(xì)胞鑒別DNA合成檢測有絲分裂圖3H－TDRBRDUPCNAKi-67心肌細(xì)胞鑒別

搏動相關(guān)蛋白檢測：MHC,肌動蛋白。DNA合成檢測

有絲分裂圖：光鏡＋組化（假陰性）3H－TDR：高特異性（放射性污染）BRDU：DNA合成底物（假陽性）PCNA：靈敏（假陽性，DNA修復(fù)期，凋亡細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞）Ki-67：僅與核分裂有關(guān)，靈敏，特異性高調(diào)控心肌細(xì)胞分裂的細(xì)胞因子胰島素樣生長因子心臟營養(yǎng)因子白介素－1成纖維生長因子1，25－（OH）2-D3其他：細(xì)胞周期素，細(xì)胞周期蛋白依賴激酶（CDK），CDK抑制因子，P21，P27，TGF-?成體干細(xì)胞在心臟疾病中的應(yīng)用

干細(xì)胞可分為胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞。由于胚胎干細(xì)胞移植存在著免疫排斥，從而限制了其在臨床上的應(yīng)用。近年來發(fā)現(xiàn)多種組織來源的成體干細(xì)胞存在著多向分化潛能，在特定條件下可定向誘導(dǎo)分化為多種組織的功能細(xì)胞。成體干細(xì)胞作為成年新生心肌細(xì)胞的重要來源之一，在心臟疾病中的治療中受到極大關(guān)注，其最大優(yōu)點(diǎn)是避免排斥反應(yīng)，因而有望優(yōu)先進(jìn)入臨床使用。成體干細(xì)胞與缺血的心肌組織

造血干細(xì)胞：移植到裸鼠的體內(nèi),10周后制成心肌缺血再灌注損傷的模型,發(fā)現(xiàn)造血干細(xì)胞遷移到心肌受損傷的病灶內(nèi),并形成新生血管及心肌細(xì)胞。單個核細(xì)胞（成人外周血）體外培養(yǎng)7天獲得的造血干細(xì)胞靜脈注射給心肌梗死大鼠7天后：在缺血的心肌組織中聚集著標(biāo)記的造血干細(xì)胞已轉(zhuǎn)化為血管母細(xì)胞，并整合到局部新生的血管中/28天后超聲檢查：心功能得到改善，梗死區(qū)周圍以及缺血區(qū)域的血管密度增加，右心室瘢痕較對照組減小。成體干細(xì)胞與缺血的心肌組織

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞：3周后缺血心肌組織的血供明顯改善。血管造影表明，側(cè)支循環(huán)的數(shù)目增加5-7倍，新生的毛細(xì)血管與宿主的血管網(wǎng)相通，且有舒縮反應(yīng)/注入到結(jié)扎左冠狀動脈2周后的小鼠升主動脈內(nèi)病灶內(nèi),形成新生的心肌細(xì)胞或成纖維細(xì)胞成體干細(xì)胞與缺血的心肌組織

成體干細(xì)胞與心肌梗死骨髓造血干細(xì)胞：直接注入到裸鼠心臟的心肌梗死病灶周圍,心功能指標(biāo)有明顯改善;九天后病檢發(fā)現(xiàn),在心肌梗死病灶周圍由新生血管樣結(jié)構(gòu)及心肌細(xì)胞組成的新生組織,而對照組未見此結(jié)果。骨骼肌成肌細(xì)胞：將經(jīng)處理的骨骼肌成肌細(xì)胞注入到一位等待接受心臟移植的志愿病人心臟內(nèi),結(jié)果發(fā)現(xiàn)心臟能在較長時間內(nèi)工作良好而無須接受心臟移植。將大約7X106個骨骼肌成肌細(xì)胞自體植入兔的心肌組織的瘢痕邊緣中，發(fā)現(xiàn)成肌細(xì)胞可以修復(fù)心肌的瘢痕組織

成體干細(xì)胞與心肌梗死

成體干細(xì)胞與心肌梗死骨骼肌的成肌細(xì)胞：植入心肌梗死組織中，2周后該細(xì)胞表達(dá)慢收縮細(xì)胞的標(biāo)志物肌凝蛋白重鏈，而不是心肌細(xì)胞特異的標(biāo)志物肌凝蛋白。它在心肌瘢痕組織內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)榭蛊诘穆磻?yīng)纖維，以適應(yīng)心肌的負(fù)荷及做功，說明移植的骨骼肌成肌細(xì)胞不是分化為心肌細(xì)胞，而是分化成為能夠負(fù)擔(dān)心肌工作的慢收縮細(xì)胞。植入心肌組織的成肌細(xì)胞在超微結(jié)構(gòu)上與正常心肌細(xì)胞不同，它們?nèi)狈及M帶，提示骨骼肌成肌細(xì)胞可能僅僅是增加了瘢痕組織的順應(yīng)性，而不是收縮功能。因此，無收縮功能的成肌細(xì)胞的心肌植人能否與正常的心肌細(xì)胞有相似的生理功能還值得進(jìn)一步探討。成體干細(xì)胞與心肌梗死有人將同源骨骼肌成肌細(xì)胞植入大鼠心力衰竭模型的心肌組織中，研究結(jié)果表明，能夠有效地防止心室的擴(kuò)張，左心室壓力上升和下降最大速率增加，改善心臟的功能。自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的移植有助于心力衰竭患者心功能的改善，為心力衰竭的治療開辟了一個新的途徑。成體干細(xì)胞與心功能不全綜上所述，針對成年心肌細(xì)胞生長、死亡與再生的最新研究打破了長期以來將心肌細(xì)胞作為終末分化細(xì)胞的觀念，從而為相關(guān)的基礎(chǔ)及臨床研究開辟了新的方向，并隨著成體干細(xì)胞應(yīng)用的研究進(jìn)一步深入，為臨床心血管疾病的治療提供了新的前景。

前景已成為細(xì)胞移植的首選供體！多向分化潛能取材方便不存在倫理問題高度自我更新能力自體移植無免疫排斥反應(yīng)可促進(jìn)血管新生優(yōu)點(diǎn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）大量研究表明：BMSCs在一定條件下可誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞（CM）及血管內(nèi)皮細(xì)胞，目前關(guān)于其分化的機(jī)制尚未明確，有學(xué)者提出，環(huán)境誘導(dǎo)分化是其中的重要因素。環(huán)境誘導(dǎo)分化環(huán)境誘導(dǎo)分化是干細(xì)胞進(jìn)入微環(huán)境后受周圍細(xì)胞的影響，對相應(yīng)的各種物理或化學(xué)信號做出反應(yīng)。其機(jī)制可能與細(xì)胞接觸、基因水平調(diào)控、細(xì)胞因子調(diào)控等有關(guān)。GFP-BMSCsCM光鏡下(10X20)熒光顯微鏡下(10X20)共培養(yǎng)前GFP-BMSCs與CM的形態(tài)學(xué)特征共培養(yǎng)后抗TroponinI染色陽性的BMSCs

GFP(綠)Torpo-3(藍(lán))重疊

TroponinI(紅)共聚焦顯微鏡下觀察染色結(jié)果(10X40)抗α-actinin、抗MEF-2C染色陽性的BMSCsα-actininMEF-2CGFPTORPO-3重疊共聚焦顯微鏡下觀察染色結(jié)果(10X40)熒光顯微鏡下搏動的GFP-BMSCs5mV25s-26mV-38mV20mV5s250ms20mV0mV-51mV正常CM膜電位改變

BMSCs獲得的心肌分化表型的膜電位改變AB電生理記錄(膜片鉗技術(shù)檢測結(jié)果)實(shí)驗(yàn)材料與儀器設(shè)備實(shí)驗(yàn)動物:

成年GFP轉(zhuǎn)基因C57BL/6小鼠（8～12周齡），雄性；成年C57BL/6小鼠（8～12周齡），雌性，購自加拿大CharlesRiver公司。試劑:同第一部分實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)分組對照組（n=3）：單純骨髓重建術(shù)，術(shù)后4w處死，觀察心肌組織中TroponinI的表達(dá)。心肌梗死組（n=4）：雌性C57BL/6小鼠經(jīng)骨髓重建后4w，行冠狀動脈左前降支（LAD）結(jié)扎術(shù)建立心肌梗死模型，術(shù)后7d處死，觀察心肌組織中TroponinI的表達(dá)。BGFP骨髓移植A輻射破壞骨髓C心梗模型建立DBMSCs歸巢及分化DamagedheartmusclecellsStemcellshelpregen