氣虛血瘀大鼠模型表征及血液流變學(xué)的動(dòng)態(tài)觀察

氣虛血瘀大鼠模型表征及血液流變學(xué)的動(dòng)態(tài)觀察

氣虛血瘀證是許多臨床疾病中的常見癥狀，尤其是老年人神經(jīng)疾病。中國已經(jīng)進(jìn)入老齡化社會(huì)，關(guān)于氣虛血瘀證的研究已成為中醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)難題。多年來,學(xué)者們一方面結(jié)合中風(fēng)病、冠心病、高血壓等臨床常見疾病從證類出現(xiàn)頻率、證候特征與診斷、臨床療效評(píng)價(jià)等宏觀角度對(duì)其進(jìn)行了系統(tǒng)研究,初步建立了臨床診斷與療效評(píng)價(jià)方法。另一方面,從血液流變學(xué)、血管調(diào)控物質(zhì)、組織形態(tài)改變等微觀角度對(duì)其生物學(xué)基礎(chǔ)做了有益探索,為科學(xué)闡明其生物學(xué)實(shí)質(zhì)奠定了基礎(chǔ)。臨床研究中,經(jīng)歷數(shù)千年的整理與總結(jié),中醫(yī)證候?qū)W形成了一套以中醫(yī)望、聞、問、切為基本信息采集方法的完備體系,這一體系經(jīng)由臨床反復(fù)驗(yàn)證,具有了較高的穩(wěn)定性和科學(xué)性。與之相對(duì),生物學(xué)基礎(chǔ)研究多是基于不同疾病、不同造模方法和不同的微觀指標(biāo)進(jìn)行的,缺乏與中醫(yī)臨床證候擬合程度衡量標(biāo)準(zhǔn),造成其科學(xué)性和穩(wěn)定性難以評(píng)價(jià),成為困擾研究深入的一大難題。因此,探索生物學(xué)基礎(chǔ)研究與臨床證候研究的相關(guān)性及其評(píng)價(jià)方法成為當(dāng)務(wù)之急。通過總結(jié)前人思路及方法,筆者提出了氣虛血瘀證動(dòng)物表征研究的新思路,并擬定了相關(guān)的表征體系。以此為依據(jù),本實(shí)驗(yàn)結(jié)合“勞則氣耗”中醫(yī)理論,以力竭游泳為主要造模手段,造成氣虛血瘀大鼠模型,在此基礎(chǔ)上,根據(jù)自擬表征體系進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察,檢測(cè)模型大鼠相關(guān)血液流變學(xué)指標(biāo)變化,探索證候生物學(xué)基礎(chǔ)及動(dòng)物模型研究的客觀評(píng)價(jià)方法。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)健康成年雄性SD大鼠60只,體質(zhì)量(200±10)g,由維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供。于實(shí)驗(yàn)前1周購進(jìn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,安靜環(huán)境分籠飼養(yǎng),溫度控制在(25±1)℃,相對(duì)濕度為60%,自由攝入水食。隨機(jī)分成正常組、模型組,30只/組。每組大鼠分別再分成1周、2周、4周組,10只/組,同時(shí)點(diǎn)兩組間相互對(duì)照。1.2適應(yīng)游泳環(huán)境模型組大鼠于造模前1周進(jìn)行游泳訓(xùn)練,隔日1次,2~3min/次,使之適應(yīng)游泳環(huán)境。實(shí)驗(yàn)過程中,正常組給予普通飼料進(jìn)食,模型組給予普通飼料加力竭游泳造模,每周第1~5天進(jìn)行力竭游泳造模,建立氣虛血瘀大鼠模型,力竭標(biāo)準(zhǔn)控制為大鼠沉入水中10s不能自行浮出水面。1.3實(shí)驗(yàn)大鼠一般情況及電生理指標(biāo)檢測(cè)模型組及正常組以力竭游泳的最后1周為檢測(cè)周,集中進(jìn)行相關(guān)表征及血液流變學(xué)檢測(cè)。于每周星期一、星期四兩天觀察皮毛色澤、爪甲顏色、精神狀態(tài)等一般狀況。同時(shí)測(cè)量大鼠體質(zhì)量、平均進(jìn)食量變化。造模期間記錄大鼠每天游泳時(shí)間,計(jì)算各周的平均游泳時(shí)間。水迷宮實(shí)驗(yàn)采用DMS-3Morris水迷宮(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所)。曠場(chǎng)分析于檢測(cè)周第6天進(jìn)行,記錄中央格停留時(shí)間、水平運(yùn)動(dòng)次數(shù)、垂直運(yùn)動(dòng)次數(shù)等數(shù)據(jù)。檢測(cè)周第7天對(duì)大鼠麻醉狀態(tài)下進(jìn)行舌質(zhì)評(píng)分,評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)自擬,同時(shí)拍攝舌圖,采用富士數(shù)碼照相機(jī)(FinePixS9500,900萬像素)。復(fù)合電生理檢測(cè)采用BIOPAC-MP150型16導(dǎo)聯(lián)多功能電生理儀,分別檢測(cè)心率、呼吸頻率、大鼠前肢末端皮膚溫度。通過以上表征檢測(cè),嘗試較為全面反映大鼠氣虛血瘀狀態(tài)。1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)使用SPSS11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,計(jì)數(shù)資料采用t檢驗(yàn),等級(jí)資料采用單因素方差分析,血液流變學(xué)指標(biāo)采用單因素方差分析,實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差2氣虛血瘀模型與大鼠相關(guān)2.1單次力竭大鼠的反應(yīng)單次力竭指在造模過程中,模型大鼠單次游泳所要達(dá)到的力竭標(biāo)準(zhǔn)及其表現(xiàn)。單次力竭后大鼠表現(xiàn)為目光呆滯,呼吸喘促,左右搖晃,無搖頭甩水現(xiàn)象,無力反抗、理毛,站立不穩(wěn),一觸即倒,見圖1。單次游泳均使大鼠達(dá)到力竭,保證了造成氣虛的施加因素持續(xù)存在。2.2慢性疲勞慢性力竭指模型大鼠在經(jīng)過多次力竭游泳后,表現(xiàn)出較為穩(wěn)定、能夠一定程度反映證候特征的宏觀表征,主要包括以下方面。2.2.1氣虛的表現(xiàn)經(jīng)過長期的力竭游泳后均表現(xiàn)出精神狀態(tài)差、活動(dòng)減少、體質(zhì)量下降、運(yùn)動(dòng)能力差、懶動(dòng)等氣虛相關(guān)表征。2.2.1.運(yùn)動(dòng)軌跡型健康大鼠表現(xiàn)靈活,眼光有神,反應(yīng)迅速,被毛光澤,爪甲紅潤光澤。力竭游泳造模后大鼠無精打采,眼微睜無神,自主活動(dòng)少,對(duì)外界反應(yīng)遲鈍,被毛黯淡枯燥,爪甲色淡。與氣虛證機(jī)體失養(yǎng)、神疲癥狀相對(duì)應(yīng)。2.2.1.不同密度的耦合數(shù)據(jù)正常組分別為28.4、26.3、25.1g,模型組分別為27.5、28.6、28.4g,見圖2?？梢娬＝M大鼠進(jìn)食量逐漸下降,與之相對(duì),模型組大鼠進(jìn)食量有所增加,可能與大鼠的力竭游泳導(dǎo)致能量消耗增加有關(guān)。2.2.1.體質(zhì)量和指數(shù)模型組大鼠體質(zhì)量增長緩慢,抓撓動(dòng)作少、動(dòng)作遲緩,2周、4周的體質(zhì)量均低于正常組,P<0.05,見表1。與氣虛證形體瘦弱癥狀相對(duì)應(yīng)。2.2.1.造模時(shí)間對(duì)大鼠運(yùn)動(dòng)能力的影響模型組大鼠1周、2周、4周的平均游泳時(shí)間分別為(50.45±32.02)min,(27.91±16.86)min,(32.80±32.67)min。2周比1周時(shí)明顯縮短,4周時(shí)于2周時(shí)接近,可見隨造模時(shí)間延長,其游泳時(shí)間有縮短的趨勢(shì),見圖3,反映了力竭游泳2周后大鼠運(yùn)動(dòng)能力降低。與氣虛證乏力癥狀相對(duì)應(yīng),乏力為人體主觀感覺,大鼠運(yùn)動(dòng)能力的降低為大鼠疲乏狀態(tài)的反映。2.2.1.5個(gè)概率分析2.2.1.水迷對(duì)大鼠定位航道和空間搜索的影響Morris水迷宮為反映大鼠空間記憶的常用實(shí)驗(yàn)之一。在本實(shí)驗(yàn)中模型組大鼠在水迷宮常見定位航道和空間搜索兩項(xiàng)指標(biāo)中與正常組比較未見明顯差異(P>0.05),見表2?？梢哉J(rèn)為,模型大鼠整體氣虛血瘀狀態(tài)可不表現(xiàn)出認(rèn)知功能損害。2.2.2血液抑郁癥的跡象2.2.2.兩組舌質(zhì)評(píng)分比較模型組大鼠自游泳1周末,舌質(zhì)開始由淡紅而見明顯紫黯,舌質(zhì)評(píng)分較正常組增高,其差異有顯著性(P<0.05)。其分值隨游泳時(shí)間延長逐漸增高,見表1。舌圖照相也與之相應(yīng)。2.2.2.2舌畫3血液流變學(xué)結(jié)果3.1全血黏度測(cè)定血黏度方面,模型組2周末血漿黏度增高(P<0.05),全血黏度未見有顯著差異。見表3。說明經(jīng)過力竭游泳2周,可能引起血漿成分的變化。3.2數(shù)在力竭游泳后出現(xiàn)降低趨勢(shì)紅細(xì)變形性方面各組均未見明顯變化。紅細(xì)胞聚集指數(shù)在力竭游泳后出現(xiàn)了降低趨勢(shì),見表3。其中1周、2周末較正常組為低,差異顯著(P<0.05),4周末結(jié)果增高,但差異無顯著性。3.3血液大氣壓aptt凝血相關(guān)指標(biāo)方面,模型組PT1周、2周(P<0.01)、4周(P<0.05)末時(shí)縮短,較正常組差異顯著。APTT在4周末時(shí)明顯縮短,差異顯著(P<0.01)。反映了模型大鼠血液存在高凝狀態(tài)。FIB含量1周末時(shí)較正常組有所增高,但差異無顯著性,2周末時(shí)接近于正常組,4周末時(shí)較正常組反而有所降低,差異顯著(P<0.05),見表3。4血液流變學(xué)指標(biāo)檢測(cè)臨床應(yīng)用特點(diǎn)是臨床研究的重要發(fā)現(xiàn)動(dòng)物模型研究為氣虛血瘀證生物學(xué)基礎(chǔ)研究的重要手段,主要包括結(jié)合病因造模、病理模擬造模及病證結(jié)合造模等不同方法結(jié)果顯示模型大鼠在力竭游泳后,表現(xiàn)出精神狀態(tài)差、體質(zhì)量下降、游泳時(shí)間縮短、曠場(chǎng)分析中央格時(shí)間延長、短暫的排便增多等,分別與氣虛證的倦怠、消瘦、乏力、懶動(dòng)、便溏等證候特征相應(yīng),因此可以作為反映氣虛的敏感表征。而舌質(zhì)紫黯則為反映血瘀的敏感表征,這一點(diǎn)與臨床研究中人體特征相一致。以上表征的確立,同時(shí)證明以力竭游泳為造模手段造成氣虛血瘀的動(dòng)物模型是科學(xué)可行的。血液流變學(xué)指標(biāo)主要包括血黏度、紅細(xì)胞變形性、紅細(xì)胞聚集性、紅細(xì)胞壓積、血小板聚集性、血小板黏附性、凝血因子、血漿纖維蛋白等,概括起來有濃、黏、凝、聚幾個(gè)主要方面。臨床上,血液流變學(xué)改變?yōu)檠鲎C研究的重要指標(biāo),以往研究中,血瘀證血液流變學(xué)特征主要包括血液黏度增高、血小板黏附率增高、凝血時(shí)間縮短、纖維蛋白原含量增高等。1986年第2屆全國活血化瘀研究學(xué)術(shù)會(huì)議,將血液流變學(xué)指標(biāo)的變化列為血瘀證的診斷標(biāo)準(zhǔn)之一既往有關(guān)氣虛血瘀證的血液流變學(xué)特征研究多集中在臨床方面,以人體疾病狀態(tài)下的血液流變學(xué)變化為主要研究對(duì)象,其結(jié)果多與血瘀證相類。而對(duì)動(dòng)物模型血液流變學(xué)變化缺乏系統(tǒng)研究和成熟理論觀點(diǎn)。本研究中模型大鼠力竭游泳后血液流變學(xué)改變突出的表現(xiàn)為凝血指標(biāo)的異常,包括PT、APTT值的降低,另外還包括血漿黏度降低,紅細(xì)胞聚集指數(shù)及纖維蛋白原降低等。這一結(jié)果與臨床研究不完全一致,部分指標(biāo)支持了血瘀的存在,部分指標(biāo)雖有變化,但波動(dòng)較大?？紤]動(dòng)物模型模擬的僅為氣虛血瘀狀態(tài),不表現(xiàn)為具體的疾病,因此這一特征是否為本動(dòng)物模型所特有,有待于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)結(jié)果的驗(yàn)證。1.4全血黏度、低血壓、蛋白、響應(yīng)面模型大鼠的理化指標(biāo)檢測(cè)于1周、2周、4周末分別取正常組及模型組大鼠各10只,使用10%水合氯醛按照3.5mL/kg體質(zhì)量的比例腹腔注射麻醉,腹主動(dòng)脈取血檢測(cè)血液流變學(xué)指標(biāo)。采用肝素抗凝管取血3mL,檢測(cè)全血黏稠度、血漿黏度及紅細(xì)胞變形、聚集指數(shù)。采枸櫞酸鈉抗凝管取血3mL,離心后分別取上清檢測(cè)凝血酶原時(shí)間(PT)、活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)、纖維蛋白原含量(FIB)。全血黏度及血漿黏度采用普利生全自動(dòng)自清洗血流變儀LBY-N6B及微量血漿測(cè)試裝置(錐板法)檢測(cè)。紅細(xì)胞變性聚集采用普利生LDY-DX3紅細(xì)胞變形儀檢測(cè)。血凝指標(biāo)采用普利生C2000-2型高性能血凝儀(磁珠法)檢測(cè)。離心使用EpendorfCentrifuge5810R高速冷凍離心機(jī)。模型組大鼠中央格停留時(shí)間,2、4周時(shí)較正常組有所延長(P<0.05),見表1,反映了模型大鼠的膽怯和懶動(dòng)狀態(tài)。水平運(yùn)動(dòng)、垂