反向膠束萃取技術(shù)

1、反相膠束萃取技術(shù)Reversed Micelle Extraction 報(bào)告人： 熊瑤一、反相膠束萃取概況 反相膠束萃取技術(shù)的提出 溶液萃取法主要包括溶劑萃取 、雙水相萃取和反膠束萃取。 生物大分子物質(zhì)一般在4050以上開始變性； 絕大多數(shù)生物大分子物質(zhì)不溶于有機(jī)溶劑； 有機(jī)溶劑也易引起生物大分子物質(zhì)的變性； 生物大分子表面帶有許多電荷，普通離子締合型 萃取劑很難奏效。 提取與分離酶蛋白的方法既要有高選擇性又要不影響酶蛋白的活性，傳統(tǒng)溶劑萃取并不適合；雙水相萃取雖然可以保留產(chǎn)物的活性，但是由于成本較高真正工業(yè)化的例子很好；反膠束萃取成本低，溶劑可反復(fù)使用，萃取率高等特點(diǎn)，對生物大分子分離提取具

2、有很好的發(fā)展前景。 二、反相膠束萃取的概念反相膠束（reversed micelle）：當(dāng)表面活性劑在非極性溶液中形成膠束或微膠團(tuán)時(shí)，表面活性劑的排列方向正好與在極性溶劑中的情況相反，即疏水性基團(tuán)朝外，而親水性基團(tuán)則朝內(nèi)并形成一個(gè)極性核區(qū)，由于這種微膠團(tuán)結(jié)構(gòu)與正常微膠束結(jié)構(gòu)相反，所以稱這種微膠束稱為反相微膠束。水池(water pool) ：在反相微膠束中，表面活性劑的親水基團(tuán)所圍成的一個(gè)極性核心，稱為水池。反相膠束萃?。喝绱蛛x組分是以反相微膠束（團(tuán)）的形式被萃取的過程，就稱之為反向微膠束萃取或反向微膠團(tuán)萃取。 圖 蛋白質(zhì)在反膠束中的溶解過程 反膠束溶液是透明的，熱力學(xué)穩(wěn)定的系統(tǒng)。它由表面活

3、性劑，有機(jī)溶劑和水組成。 表面活性劑是由親水憎油 的極性基團(tuán)和親油憎水的 非極性基團(tuán)組成的兩性分 子。表面活性劑表面活性劑有機(jī)溶劑有機(jī)溶劑AOTAOT 丁二酸丁二酸-2-2-乙乙基己基酯磺酸鈉基己基酯磺酸鈉n-n-烴類（烴類（C6C6C10C10）、）、異辛烷、環(huán)已烷、四異辛烷、環(huán)已烷、四氯化碳、苯氯化碳、苯CTABCTAB 溴化十六烷溴化十六烷三甲基銨三甲基銨已醇已醇/ /異辛烷，已醇異辛烷，已醇/ /辛烷，三氯甲烷辛烷，三氯甲烷/ /辛辛烷烷TOMACTOMAC 三辛基甲基三辛基甲基氯化銨氯化銨 環(huán)已烷環(huán)已烷Brij60Brij60 聚氧乙烯聚氧乙烯月桂醇醚月桂醇醚 辛烷辛烷Triton

4、XTriton X 烷基酚烷基酚聚氧乙烯聚氧乙烯 已醇已醇/ /環(huán)己烷環(huán)己烷磷脂酰膽堿磷脂酰膽堿苯、庚烷苯、庚烷磷脂酰乙醇胺磷脂酰乙醇胺苯、庚烷苯、庚烷在反膠束萃取蛋白質(zhì)的研究中，用得最多的是陰離子表面活性劑AOT，學(xué)名丁二酸2乙基己基酯磺酸鈉，結(jié)構(gòu)式如下圖 AOT容易獲得，具有雙鏈，極性基團(tuán)較小，形成反腔束臨界膠束濃度較低，并且形成的反膠束較大，有利于大分子蛋白質(zhì)的進(jìn)入 臨界膠束濃度（Critical micelle concentration) 臨界膠束濃度：是膠束形成時(shí)所需的表面活性劑的最低濃度，用CMC來表示。與表面活性劑化學(xué)結(jié)構(gòu)、溶劑、溫度、壓力等因素有關(guān)。CMC值可通過測定表面活性

5、劑各種物理性質(zhì)的突變(如表面張力，滲透壓、濁度、當(dāng)量電導(dǎo)等)來確定。圖顯示了表面活性劑十二烷基磺酸鈉與溶液物理化學(xué)性質(zhì)的關(guān)系，在特征濃度為0.008 molL時(shí)各性質(zhì)都有一個(gè)突變現(xiàn)象，此時(shí)表面活性劑的濃度就是十二烷基磺酸鈉在此溶劑中的臨界膠束濃度 反膠束的形狀與大小 反膠束的大小取決于反膠束的含水量W0。 含水量是指反膠束中水分子數(shù)與表面活性劑分子數(shù)之比。 W0=H2Osurfactan 由于每個(gè)表面活性劑極性基團(tuán)有一定的有效面積，因此，它決定了反膠束的大小和每個(gè)反膠束中表面活性劑的分子數(shù)。 在反膠束溶液與水相平衡的情況下， W0值取決于表面活性劑的種類、溶劑的類型、表面活性助劑、水相中鹽的種

6、類和鹽的濃度等。 蛋白質(zhì)進(jìn)入反膠束后，會(huì)使反膠束的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。如大小、聚集數(shù)和W0等改變，這些變化的基本機(jī)理目前不太清楚。三、反相膠束萃取的基本原理 在反相膠束萃取過程中，蛋白質(zhì)或酶等生物大分子主要以水殼膜形式存在于反相微膠團(tuán)的極性核心內(nèi)部，避免了與有機(jī)溶劑直接接觸，保持整個(gè)萃取過程中生物大分子的活性，實(shí)現(xiàn)了既能溶出酶及蛋白質(zhì)等生物大分子，又能與水分相分離，并能保持這些生物大分子的生物活性。 以水AOT異辛烷系統(tǒng)為例演示反膠束萃取蛋白質(zhì)原理在宏觀兩相(有機(jī)相和水相)界面間的表面活性劑層，同鄰近的蛋白質(zhì)發(fā)生靜電作用而變形，接著在兩相界面形成了包含有蛋白質(zhì)的反膠束，此反膠束擴(kuò)散進(jìn)入有機(jī)相中，從而

7、實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的萃取。蛋白質(zhì)進(jìn)入反膠束溶液是一種協(xié)同過程。改變水相條件(如pH值、離子種類、強(qiáng)度等)又可使蛋白質(zhì)由有機(jī)相重新返回水相，實(shí)現(xiàn)反萃取過程。 1.蛋白質(zhì)在微膠束中的結(jié)合方式 （1） “水殼”模型反膠束系統(tǒng)中水通常可分結(jié)合水和自由水。結(jié)合水是指位于反膠束內(nèi)部形成水池的水，自由水是存在于水相中的水。蛋白質(zhì)在反膠束內(nèi)的溶解情況可用水殼模型解釋：大分子蛋白質(zhì)被封閉在“水池”中，表面存在一層水化層與膠束內(nèi)表面分開，使蛋白質(zhì)不與有機(jī)溶劑直接接觸。水殼模型較好地解釋了蛋白質(zhì)在反膠束內(nèi)的存在狀態(tài)。1、從彈性光散射的研究證實(shí)在蛋白質(zhì)分子周圍至少存在一個(gè)單分子水層；2、糜蛋白酶在反膠束中的熒光特性與在水中特

8、性相象；3、反膠束中酶所顯示的動(dòng)力學(xué)特性接近于在水中的特性等，這些事實(shí)都有力地支持了水殼模型。(2)“吸附”模型 “吸附”模型認(rèn)為生物大分子雖然溶解于由表面活性劑極性部分圍成的中心中，但在中心部分生物大分子是以被吸附的狀態(tài)附著于膠團(tuán)的極性壁上(3)疏水基“架連”模型 該模型認(rèn)為生物大分子的非極性部分與多個(gè)微膠團(tuán)的非極性部分連接，由此形成生物大分子溶解于多個(gè)微膠團(tuán)之間的一種狀態(tài)四、反相膠束萃取的方法 反相微膠團(tuán)萃取分離過程分兩步： 形成含生物大分子的反相微膠團(tuán)最常用到的方法有3種。 相轉(zhuǎn)移法 通過將含生物大分子的水相與溶解有 表面活性劑的有機(jī)相接觸，緩慢地?cái)?拌，在形成反向微膠團(tuán)的同時(shí)，其中 的

9、生物大分子即轉(zhuǎn)入到反相微膠團(tuán)中， 直到處于萃取平衡狀態(tài)為止。含生物大分子的反相微膠團(tuán)的形成反相微膠團(tuán)的破乳及生物大分子的釋放 注入法 通過將含有生物大分子的水溶液注入到含有表面活性劑的有機(jī)相中，從而實(shí)現(xiàn)萃取過程。 溶解法 對于固體粉末中的生物大分子，或不溶于水的生物大分子，可采用溶解法進(jìn)行。先制備好含水(w0 =330左右)的反相微膠束的有機(jī)溶液，然后把含生物大分子的固體粉末加入此種反相微膠團(tuán)的有機(jī)溶液中，同時(shí)攪拌，生物大分子慢慢即可進(jìn)入到反相微膠團(tuán)內(nèi)的水池中心而實(shí)現(xiàn)萃取過程。五、簡單且敏感的AOT/異辛烷反相膠束方法測定脂肪氧合酶 1.介紹和說明 脂肪氧合酶在動(dòng)物界廣泛存在，在豆類中具有較高

10、的活力，尤其以大豆中的活力為最高。屬于氧化還原酶，是一類含非血紅鐵素的蛋白質(zhì)，能轉(zhuǎn)一催化具有順，順4-希結(jié)構(gòu)的多不飽和脂肪酸，通過分子內(nèi)加氧，形成具有共軛雙鍵的氫過氧化衍生物。 脂肪氧合酶對它作用的底物具有結(jié)構(gòu)特異性的要求，在植物中其天然底物主要是亞油酸和亞麻酸。 測定脂肪氧合酶的活性方法： 比色法、燃料溶液漂白方法、分光光度法。其中分光光度法是最為人們所接受的一種方法，但是這個(gè)方法有兩個(gè)局限性： 粗酶液中含有其他吸收紫外光的材料，光譜分析的敏感度降低甚至失去敏感度。 低水溶性脂肪酸引起的濁度回干擾吸光度的讀數(shù)。 2.材料和方法 2.1材料 大豆脂肪氧合酶 丁二酸-2-乙基己基酯磺酸鈉（AOT

11、） 異辛烷 環(huán)己烷 正己烷 十六烷 亞油酸 乙醇 2.2反相膠束的制備 AOT/異辛烷反膠束溶液的配制:按一定質(zhì)量濃度配制反膠束溶液,稱取AOT 置于100mL的錐形瓶中,同時(shí)加入有機(jī)溶劑異辛烷,在磁力攪拌器上攪拌至AOT完全溶解待溶液透明。 將大豆中提取的原油酶液溶于pH=9.0的5mM的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽中。 2.3脂肪氧合酶的測定過程 AOT/異辛烷反相膠束溶液在800rpm，25oc的水浴中處理，然后添加亞油酸原液配成25m亞油酸/5ml反相膠束溶液。反應(yīng)一段時(shí)間后，在確定的間隔時(shí)間內(nèi)取樣且用1.8ml的異辛烷稀釋，然后添加30的乙醇水溶液，離心10min后分離。在234nm處測定

12、上清夜的吸光度。 加熱使酶失活，然后用同樣的步驟做空白對照實(shí)驗(yàn)，做校準(zhǔn)曲線。 2.4用反相膠束測定脂肪氧合酶活性的實(shí)際應(yīng)用 以大豆，黑大豆，紅豆三種豆科植物為例。 在4環(huán)境中用上面三種植物提取粗酶液，添加到三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽中，攪拌均勻。30min離心分離后，上清液用膜濾器過濾。濾液用飽和度為80的硫酸銨鹽沉淀分離，離心分離30min。然后溶于三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液中隔夜處理。 3.結(jié)果與討論 3.1AOT對反相膠束測定脂肪氧合酶活性的影響 一個(gè)主要的局限就是AOT作為表面活性劑具有強(qiáng)的紫外吸收作用。 為了克服這一干擾，清楚AOT是必須得。 去除反相膠束中的AOT是通過在溶液中添加乙

13、醇水溶液實(shí)現(xiàn)的。 AOT的去除效率依賴于AOT的濃度 3.2有機(jī)溶劑的選擇 環(huán)己烷、正庚烷、正己烷、異辛烷和十六烷這五種有機(jī)溶劑經(jīng)常用于反相膠束中測定脂肪酶的活性。 在測定脂肪氧合酶活性的反相膠束溶劑中異辛烷是最有效的。 根據(jù)報(bào)道，logP為溶液極性的值，用它表示在有機(jī)溶劑中酯酶和脂肪氧合酶的催化活性。 親水性溶劑中l(wèi)ogP2 溫和性溶劑中l(wèi)ogP為2和4 高疏水性溶劑中l(wèi)ogP4 有機(jī)溶劑分子結(jié)構(gòu)的差異。 通過測試環(huán)己烷、異辛烷和一些直連烷烴有機(jī)溶劑，得出短C鏈可與AOT分子嵌入形成的界面膜中，碳?xì)浠衔飼?huì)在界面膜上形成一個(gè)附加層，大部分的飽和烴滲析進(jìn)入反相膠束的表面活性劑上，阻礙了脂肪氧合酶與底物之間的相互作用。 由上述可以得出的是，脂肪氧合酶的活性與有機(jī)溶劑的logP值沒有關(guān)系，而是取決于有機(jī)溶劑的結(jié)構(gòu)。 因此，異辛烷作為反相膠束的有機(jī)溶劑進(jìn)行進(jìn)一步的研究。 3.3水含量對AOT/異辛烷反相膠束的影響 反相膠束中水含量對生物催化活性的大小是一個(gè)關(guān)鍵的因素，并且它甚至?xí)绊憙?nèi)部