水楊酸及其衍生物對溶菌酶光敏損傷的保護(hù)作用分析

第17卷第1期 2012年1月 集美大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版) Journal of Jimei University(Natural Science) V0117 No1 Jan2011 文章編號10077405(2012)01-0020-06 水楊酸及其衍生物對溶菌酶光敏損傷的保護(hù)作用分析 鮑小丹，馬建華 (集美大學(xué)生物工程學(xué)院，福建廈門361021) 摘要利用十二烷基磺酸鈉一聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDSPAGE)，研究了365 nm紫外照射弓I發(fā)蒽 醌一2一磺酸鈉(AQS)、溶菌酶(Lysozyme)和水楊酸及其衍生物(水楊醛、水楊酸甲酯)水溶液體系的 光化學(xué)反應(yīng)效應(yīng)及影響因子結(jié)果表明：AQS能夠造成Lyso的光敏損傷，且損傷程度隨AQS濃度增加及 光照時(shí)間的延長而加??；水楊酸及其衍生物對Lyso的光敏損傷具有顯著的保護(hù)作用，其保護(hù)效果與水楊酸 及其衍生物的濃度呈正相關(guān)；以抗壞血酸(Vc)作為對照，相同條件下，其保護(hù)效果依次為：水楊酸一水 楊醛Vc水楊酸甲酯 關(guān)鍵詞蒽醌一2一磺酸鈉；溶菌酶；光敏損傷；SDSPAGE；水楊酸；衍生物 中圖分類號O 62531 文獻(xiàn)標(biāo)志碼A Analysis of Protective Action of Salicylic Acid and Its Ramification on Photooxidation Damaged to Lysozyme BAO Xiaodan，MA Jianhua (School of Biotechnology Engineering，Jimei University，Xiamen 361021，China) Abstract：The photochemical reactions and their influence between anthraquinone-2一sulfonic acid (AQS)，lysozyme，salicylic acid and its ramification by irradiation under 365 nm were investigated using SO dium dodecyl sulfatepolyaerylamide gel electrophoresis(SDSPAGE)The results showed that lysozyme was photooxidated by AQS，and the damage was dependent on the concentration of AQS as well as the UV treat ment timeSalicylic acid and its ramification could significantly protect the photooxidation of lysozyme，and the protective effect had positive correlation with their concentrationCompared with ascorbic acid(Vc)， the efficiency of protection was successively as followssalicylic acidsalicyl aldehydeVcmethyl salicy late Key words：AQS；lysozyme；photooxidation；SDSPAGE；salicylic acid；ramification O 引言 水楊酸(Salicylic acid，SA)是植物體內(nèi)產(chǎn)生的一種簡單酚類化合物，也是植物組織中的一種天 然活性物質(zhì)研究認(rèn)為，水楊酸是激活植物過敏反應(yīng)和系統(tǒng)獲得性抗性的內(nèi)源信號分子，并在植物的 抗病、抗低溫、抗旱、抗鹽和抗紫外線等抗逆反應(yīng)中發(fā)揮誘導(dǎo)作用 引水楊酸甲酯(Methyl salicy一 收稿日期2011一o51O 修回日期20110624 基金項(xiàng)目福建省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2009J01032)；廈門市集美區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目(350211Z20092C01)； 集美大學(xué)創(chuàng)新研究團(tuán)隊(duì)專項(xiàng)基金資助項(xiàng)目(2010A007) 作者簡介鮑小丹(1985一)，女，碩士生，從事食品科學(xué)方向研究通訊作者：馬建華(1956一)，女，教 授，從事食品化學(xué)方向研究，E-mail：jianhuam1957126eom 第1期 鮑小丹，等：水楊酸及其衍生物對溶菌酶光敏損傷的保護(hù)作用分析 2l late)和水楊醛(Salicyl aldehyde)作為水楊酸的衍生物對植物的防御機(jī)制也有重要的作用 植物 對非生物逆境耐受能力的提高源于外源性水楊酸對抗氧化酶活性的調(diào)節(jié)作用 J此外，水楊酸及其 衍生物作為一種酚類化合物，其本身對自由基侵害有一定的防御能力馬建華 研究認(rèn)為，水楊酸 甲酯能快速有效地清除羥基自由基黃娟【1剛研究表明，在水溶液和微乳液體系中水楊酸及水楊酸甲 酯能有效地清除單線態(tài)氧及阻斷對亞硝胺的合成作用 蒽醌及其衍生物歷來被用作強(qiáng)光敏劑的模型化合物卜 J而且，有蒽醌及其衍生物對DNA光敏 損傷的相關(guān)研究：馬建華等-l 用激光光解研究了蒽醌一2一磺酸鈉(AQS)與高聚鳥嘌呤核苷酸的相 互作用，并闡明了反應(yīng)機(jī)理；劉玉俠等u 用不同取代基的蒽醌衍生物與G一四聯(lián)體進(jìn)行作用，揭示 了不同的光敏損傷機(jī)制；陳年友等-I 用合成的卟啉一蒽醌類衍生物對DNA進(jìn)行斷裂，效果明顯但 蒽及其衍生物對蛋白質(zhì)光敏損傷的研究報(bào)道則很少，尤其利用水楊酸及其衍生物拮抗或消除以AQS 對蛋白質(zhì)光敏損傷的研究目前未見相關(guān)報(bào)道本文以Lyso為模型蛋白質(zhì)，以AQS為光敏劑，利用 SDSPAGE研究了365 nm紫外光照條件引發(fā)AQS對Lyso的光敏損傷作用，并研究了水楊酸及其衍 生物對Lyso光敏損傷的保護(hù)作用 1材料與方法 11儀器與試劑 ZF一20C紫外燈(上海寶山顧村電光儀器廠，中國)；垂直電泳槽MiniPill(BioRAD，美 國)；凝膠成像儀G：BOX(Syngene公司，英國)；紫外分光光度計(jì)Cary50(瓦里安公司，美國) 水楊酸、水楊酸甲酯、水楊醛均為分析純；溶菌酶(Lyso)，分子質(zhì)量為144 ku，F(xiàn)luka公司產(chǎn) 品；實(shí)驗(yàn)溶液采用超純水配制 12方法 樣品經(jīng)ZF一20C紫外燈(365 rim)輻射處理后進(jìn)行SDSPAGE實(shí)驗(yàn)用MiniPIII跑電泳，電 泳結(jié)束后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為025的考馬斯亮藍(lán)G一250染色，經(jīng)脫色液(3O甲醇一10乙酸(體積分 數(shù))脫色后，用G：BOX成像并分析結(jié)果用紫外光譜儀Cary50掃描，掃描速度為24 000 iinmin， 狹縫寬度為500 nlll，掃描時(shí)間0012 5 s ，)多士甲 厶皇口木 21光照波長的選定 圖1為測得的AQS和Lyso水溶液的紫外吸收 光譜圖由圖1可見，Lys0在300 nnl以上幾乎無 吸收為了排除紫外光照射對Lyso的影響，保證 Lyso的光敏損傷均由AQS引起，本實(shí)驗(yàn)選用了波 長為365IlTI的紫外光進(jìn)行照射 22 Lyso最適電泳濃度的選擇 圖2為不同濃度Lyso水溶液的SDSPAGE 電泳圖由圖2可以看出，Lyso是純的蛋白質(zhì)， 其分子質(zhì)量為l44 ku隨著Lyso濃度的降低， 產(chǎn)生的條帶逐漸變淺考慮到最佳濃度效果，選 用第二條帶(25 X 10一molL )的Lyso濃度 進(jìn)行后續(xù)蛋白質(zhì)電泳實(shí)驗(yàn) 23不同濃度AQS對Lyso光敏損傷的影響 圖3為2510一molL 的Lyso及不同濃 200 250 300 350 400 450 500 Arim 圖1 AQS和Lyso水溶液的紫外一可見光譜 Fig1 The UV-visible absorption spectra of AQS and Lyso aqueous solution 22 集美大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版) 第l7卷 度AQS的混合溶液置于空氣中，在365 nll波長下光照80 min后得到的電泳圖由圖3可以看出，當(dāng) AQS達(dá)到13 X 10molL 時(shí)，Lyso在2328 ku處開始出現(xiàn)較大分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)片段，該片段 約是Lyso分子質(zhì)量的2倍，說明該蛋白質(zhì)片段為二聚產(chǎn)物當(dāng)AQS達(dá)到I010一molL (即 AQS和Lyso的濃度比為4)時(shí)，在3537 ku處出現(xiàn)第三條條帶，其分子質(zhì)量近似為Lyso分子質(zhì)量 的25倍，并隨AQS濃度的增加，其強(qiáng)度繼續(xù)增強(qiáng)表明，隨著AQS濃度的增加，Lyso的損傷加劇， 且除了蛋白質(zhì)的交聯(lián)反應(yīng)外，還發(fā)生了蛋白質(zhì)的斷裂，斷裂的小分子繼續(xù)與二聚體反應(yīng)生成分子質(zhì)量 為3537 ku的產(chǎn)物 ku 116 66 45 35 25 18 14 說明：M-Marker；19一Lyso溶液其濃度分別為5x10 25xlO，125x10,625x10 ，312xlO ，156x10 moL一 說明：MMarke ；C一對照組；16一AQS，其濃度分別為 0，13x10,27x10 ，53xlO ，10xl0，20xl0 toolL Notes：M-Marker；19-Lyso solutions，their concentrations are 5xlO_4， N0tes：MMarker；CC0ntr0l；16一AQS，their concentrations are 0， 25x10 ，125x10,625x10-5,312xlO ，15610 toolL 13xlO,27xlO,53xlO 10x10-320xl0too1L一 圈2不同濃度的Lyso溶液凝膠m_llt 圖3不同濃度AQS對Lyso光敏損傷的凝膠電泳圖 Fig2 Gel electrophoresis pattern presents different Fig3 Gel electrophoresis pattern presents the effect of cOncentraliOns of Lyso solution different concentrations of AQS on the photodamage of Lyso 24不同光照時(shí)間對Lyso光敏損傷的影響 圖4為2510toolL Lyso和20 X 10一molL AQS的混合溶液光照不同時(shí)間 后的SDSPAGE電泳圖由圖4可知，光照 10 min后即在2328 ku處出現(xiàn)第二條條帶， 光照40 min后開始在3537 ku處出現(xiàn)第三條 條帶，且隨光照時(shí)間的延長損傷的條帶越來越 明顯，至80100 min時(shí)損傷條帶清晰可見， 但沒有出現(xiàn)更多的條帶結(jié)果表明，隨著光照 時(shí)間延長，AQS對Lyso的光敏損傷加劇，結(jié) 果與AQS的濃度變化對Lyso的光敏損傷類似 紫外光照時(shí)間的延長會產(chǎn)生更多的AQS，激發(fā) 三重態(tài)，引發(fā)光氧化反應(yīng)，并加劇Lyso的光 敏損傷但是AQS與Lyso可能以某一固定方 式結(jié)合并相互作用，從而使Lyso有相同的交 聯(lián)和斷裂位點(diǎn)，表現(xiàn)在2328 ku和35 37 ku處出現(xiàn)條帶 25水楊酸及其衍生物對Lyso光敏損傷的保 護(hù)作用 說明：MMarker；C一對照組；1725xl0 molL LySO和 20xl0。molL- AQS混合溶液，其光照時(shí)間分別為0，10，20， 40，60，80，100 min Notes：MMarker：CContr0l：1725xlO_4moL-LySO and 20xl0。molLAQS mixed solutions，their light time is 0，10，20，40，60，80， 100 minutes 圖4光照不同時(shí)間時(shí)AQS對Lyso光敏損傷的凝膠電泳圖 Fig4 Gel electrophoresis pattern presents the effect of ir- radiation time Off the photodamage of Lyso aroused by AQS 251 Vc和水楊酸及其衍生物水溶液的紫外一可見吸收光譜 0 2 O O O 4 4 M O 2 0 0 O 4 4 H 第1期 鮑小丹，等：水楊酸及其衍生物對溶菌酶光敏損傷的保護(hù)作用分析 23 10toolL )的混合溶液中，光照100 rain Mnm 后，所得到的SDSPAGE電泳結(jié)果如圖6一圖8 圖5各個(gè)水溶液的紫外一可見吸光譜 所示由圖6一圖8可知，加入較高濃度的水楊酸 Fig5 The UV-visible absorption spectra of 或水楊醛后，2328 ku和35 37 ku處的條帶強(qiáng) d 竹e maqueoussoIuton 度明顯減弱，且隨著抗氧化劑濃度的降低，條帶變得越來越明顯而較高濃度的水楊酸甲酯卻對條帶 的減弱影響不大(見圖7)這表明，加入一定濃度的水楊酸、水楊醛能有效地降低AQS對Lyso的光敏 損傷，而水楊酸甲酯對Lyso光敏損傷的拮抗效果則較弱 253水楊酸及其衍生物對Lyso光敏損傷保護(hù)能力比較 為了確定水楊酸及其衍生物對AQS光敏損傷Lyso保護(hù)作用的強(qiáng)弱，以Vc為對照，進(jìn)行對比實(shí) 驗(yàn)圖9為相同濃度的水楊酸及其衍生物(20 X 10molL-1)分別加入到Lyso和AQS混合溶液 中的電泳圖由圖9可知，水楊酸及其衍生物對Lyso的光敏損傷保護(hù)效果不同，保護(hù)效果依次為： 水楊酸 水楊醛Vc水楊酸甲酯 說明：MMarker：C一對照組：12510 mo1LLySO； 2一無抗氧化劑：3725x10 molL- LySO， 10xl0。molL-AQS和水楊酸混合液，其濃度依次為 395xl0r。，19710 。49xlO。4 24xlO ，12x10-4 mo卜L Notes：MMarker；C-Control；125x10-4 toolL一Lyso：2一No an tioxidant；37一Mixed solution with 25x10-4molL- LySO 10103 molL一 AQS and different concentration of SA,whose concen trations are 395x100197x10-349x10-2410 12lO。4molL- 說明：MMarke ；C一對照組；125xlO molL- Lyso； 2一無抗氧化劑；3725xlO molLLyso，10xl0 molL- AQS和水楊酸甲酯混合液，其濃度依次為2OxlO ，1OxlO。， 625x10 125x10 molL- Notes：M-Marker；C-Control；1-25xlO molL一 Lyso：2一N0 antioxi dant；37-Mixed solution with 25xlO。molLLyso10xl0 molL AQS and different concentration of methyl salicylate，and their concentra tionsare20x10-3,1Oxl0-3,25xl 62510-5,125xl toolL- 圖6水楊酸對AQS光敏損傷Lyso影響的凝膠電泳圖 圖7水楊酸甲酯對AQS光敏損傷Lyso影響的凝膠電泳圖 Fig6 Gel electrophoresis pattern presents the effect of salicylic acid on the photodamage of Lyso aroused by AQS Fig7 Gel electrophoresis pattern presents the effect of methyl salicylate on the photodamage of Lyso aroused by AQS O 2 0 O O 4 4 _蠶 O2 0 0 O 4 4 一蠆 M 24 集美大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版) 第17卷 說明：M-Marker；C一對照組；125xl0 mo1LLySO； 2一無抗氧化劑；372510r4 molL- l Lyso，1OxlO-3 molI AQS和水楊醛的混合液，其濃度依次為2OxlO一，1OxlO ， 25x10-4,625x10-5125x10-5 mo1L Notes：M-Marker：CContr0l：12510-4 molLLyso；2-No an tioxidant；37一Mixed solutionwith 25x10-4mo1L- Lyo, 1OX10 molLAQS and ditfierent concentrations of saliicyl ahLde- hydeznd the salicyl aldehyde concentrations are 20x1010xl0 2510_4625xIf)-3125x10 mol 圖8水楊醛對AQS光敏損傷Lyso影響的凝膠電泳圖 Fig8 Gel electrophoresis pattern presents the effect of salicyl aldehyde on the photodamage of Lysoaroused byAQS 說明：M-Marker；C一對照組；125 xl0 molL Lys。；2一無抗氧化劑；36一抗氧化劑分別為水楊 酸，水楊酸甲酯，水楊醛，Vc Notes：M-Marker；C-Comrol；1-25xlO molL一 Lys0；2一No antioxidant；3-6-the antioxidants aFe salicylic acid，methyl sal- ieylate,salicyl aldehyde and Vc 圖9不同抗氧化劑對AQS光敏損傷Lyso影響的 凝膠電泳圖 Fig9 Gel electrophoresis pattern presents the effect of different antioxidants on the photodamage of Lyso aroused by AQS 3 討論 Lyso是由129個(gè)氨基酸組成的單肽鏈蛋白酶，其結(jié)構(gòu)高度穩(wěn)定其中3個(gè)酪氨酸均位于分子的內(nèi) 部，不易暴露在溶劑中，對穩(wěn)定Lyso的結(jié)構(gòu)有重要的作用Lyso有6個(gè)色氨酸，其中4個(gè)在酶分子 表層部位，其余2個(gè)位于Lyso的活性中心部位，參與Lyso的催化過程_】 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，AQS在紫 外光照射下能光敏損傷LysoLyso在溶劑中，6個(gè)色氨酸都會不同程度地暴露出來，Lyso結(jié)構(gòu)中最易 暴露的色氨酸殘基是自由基攻擊的主要目標(biāo)之一l-l 在紫外光照射下，AQS激發(fā)三重態(tài)-l 與氨基酸 殘基發(fā)生電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)，產(chǎn)生的自由基使兩個(gè)色氨酸殘基之間成鍵，致使蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)隨著 AQS濃度的增大及光照時(shí)間的延長，溶液中自由基濃度增大，促使蛋白質(zhì)交聯(lián)反應(yīng)加劇除了色氨酸， Lyso中其他類型的氨基酸殘基(如組氨酸、酪氨酸)也可能參與反應(yīng)本實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)了3537 ku位置 處的第三條電泳條帶，說明AQS對Lys0光敏損傷不僅造成了Lyso交聯(lián)而且還使其發(fā)生了斷裂，斷裂 的小分子片段與二聚體結(jié)合產(chǎn)生了更高分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)片段 當(dāng)AQS濃度為2010一molL， 光照時(shí)間為2 h時(shí)，Lyso已很明顯發(fā)生損傷，出現(xiàn)2328 ku及3537 ku條帶關(guān)于AQS光敏造成 Lyso的斷裂位點(diǎn)還需進(jìn)一步研究 本研究結(jié)果表明，水楊酸及其衍生物的加人使Lyso的光敏損傷明顯減弱，并且保護(hù)的效果依次 為：水楊酸一水楊醛水楊酸甲酯水楊酸及其衍生物中，酚羥基與苯環(huán)屬 共軛連結(jié)，其中水楊 酸的羧基和水楊醛的醛基為吸電子基團(tuán)，苯環(huán)上的電子云向羧基或醛基偏移，苯環(huán)上電子云密度的減 小致使酚羥基上氧原子的電子云向苯環(huán)離域這樣容易使水楊酸及水楊醛與AQS的三重激發(fā)態(tài)及活 性氧反應(yīng)，失去酚羥基上的H，生成酚氧自由基從而有效減少了AQS三重激發(fā)態(tài)及活性氧對Lyso 的損傷，減輕甚至避免了蛋白質(zhì)分子的交聯(lián)及斷裂同時(shí)水楊醛通過吸收少量紫外光，減少了Lys0 經(jīng)紫外光照射引起光敏損傷相比而言，水楊酸甲酯的拮抗效果則相對較弱這可能是因?yàn)樗畻钏峒?酯的酰氧基吸電子能力相對于羧基和醛基弱得多，這樣使酚羥基上氧原子的電子云密度相對較大，不 易失去H形成酚氧自由基之故其詳細(xì)的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究 0 2 O 0 0 4 4 0 2 0 O 0 4 4 第1期 鮑小丹，等：水楊酸及其衍生物對溶菌酶光敏損傷的保護(hù)作用分析 25 4 結(jié)論 365 nm紫外光能夠引發(fā)AQS光敏損傷Lyso，導(dǎo)致肽鍵的交聯(lián)和斷裂；Lyso的損傷程度隨AQS濃 度的增大而增大，隨光照時(shí)間的延長而加??；水楊酸、水楊酸甲酯、水楊醛均能有效保護(hù)AQS對 Lyso的光敏損傷，且隨水楊酸及其衍生物濃度的升高其保護(hù)作用增強(qiáng)，其保護(hù)效果：水楊酸一水楊醛 水楊酸甲酯 參考文獻(xiàn) 1孟雪嬌，邸昆，丁國華水楊酸在植物體內(nèi)的生理作用研究進(jìn)展J中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2010，26(15)：207214 2易小林，楊丙賢，宗學(xué)鳳，等信號分子水楊酸減緩干旱脅迫對紫御谷光合和膜脂過氧化的副效應(yīng)J生態(tài) 學(xué)報(bào)，2011，31(1)：67-74 3李亞，張鋼，張玉星，等水楊酸對大葉黃楊莖抗寒性和電阻抗圖譜參數(shù)的影響J生態(tài)學(xué)雜志，2010， 29(3)：460-466 4SAYYARI M，BABALAR M，KALANTARI S，et a1Vapour treatments with methyl salicylate or methyl jasmonate allevi ated chilling injury and enhanced antioxidant potential during postharvest storage of pomegranatesJ Food Chemistry， 2010，124(2011)：964970 5ERAsLAN F，INAL A，GUNES A，et a1Impact of exogenous salicylic acid on the growth，antioxidam activity and physiology of carrot plants subjected to combined salinity and boron toxicityJScientia Horticuhurae，2007，1 13(2)： 120128 6YUSUF M，HASAN S A，ALI B，ct a1Effect of salicylic acid on salinityinduced changes in Brassica unceaJ Journal of Integrative Plant Biology，2008，50(9)：1096